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木木学姐

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课程介绍：

氨基酸、肽、蛋白质专题

氨基酸01氨基酸的记忆方法

方法一：

含羟基氨基酸：苏(Thr)轼(Ser)喜青羊(-OH)

含硫氨基酸：加(Met)班(Cys)遇寒流(含硫)

中性脂肪族氨基酸：一(lle)两(Leu)饼(Ala)干(Gly)屑(Val)混入脂肪中(中性脂肪酸)

芳香族氨基酸：偶遇访(芳香族)华老(Tyr)赫(和)本(Phe)杂环族氨基酸:五味杂(杂环)陈，果脯(Pro)朱(His)色(Trp)

酸性氨基酸及酰胺：酸(酸性)甜冬(Asp)菇(Glu)河(和)两岸(Asn，GIn)

碱性氨基酸：来(Lys)京(Ar)为钱行(碱性)

必需氨基酸：一(lle)些(Val)笨兵(Phe)来(Lys)数(Thr)亮(Leu)色(Trp)蛋(Met)

方法二：

甘丙缬亮异，支链；

丝苏半蛋，羟硫添；

天谷赖精组，酸碱脯酪苯色，杂芳环；

天冬酰胺、谷酰氨；

都有密码属常见。

方法三：

六伴穷光蛋：硫，半、光、蛋→半胱、胱、蛋(甲硫)氨酸→含硫氨基酸

酸谷天出门：酸，谷、天→谷氨酸、天冬氨酸→酸性氨基酸

死猪肝色脸：丝、组、甘、色→丝、组、甘、色氨酸→-碳单位来源的氨基酸

只携一两钱：支，缬、异亮、亮→缬、异亮、亮氨酸→支链氨基酸

一本落色书：异、苯、酪、色、苏→异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸→生糖兼生酮

拣来精读之：碱，赖、精、组→赖氨酸、精氨酸、组氨酸→碱性氨基酸

芳香老本色：芳香，酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸

不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖→脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸→不参与转氨基的氨基酸

方法四：

必须氨基酸：

一两色素本来淡些

甲携来一本亮色书

02氨基酸的等电点

pH>pl时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COOH-，向正极移动。

pH=pl时，氨基酸净电荷为零。

pH<pl时，氨基酸带正电荷，-NH2，解离成-NH+，向负极移动。

实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。

03氨基酸的性质--物理性质

α-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可用来鉴别各种氨基酸。除了胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。

除甘氨酸外，α-氨基酸都有旋光性，具有手性。苏氨酸和异亮氨酸具有两个手性碳原子。从蛋白质水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物体内特别是细菌中，D-氨基酸也存在。

三个带苯环的氨基酸都有紫外吸收，通常蛋白质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的，一般在280nm。

氨基酸是两性电解质。当氨基酸分子所带的净电荷为零时的pH称为氨基酸的等电点(pl)。

氨基酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离基团的表观解离常数按酸碱性减弱的顺序。氨基酸可作为缓冲溶液，pl处缓冲能力最弱。

04氨基酸的性质--化学性质

1.氨基的反应

(1)酰化

氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应，生成酰胺。该反应在多肽合成中可用于保护氨基。

(2)与亚硝酸作用

氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。因为伯胺都有这个反应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度较慢。常用干蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。

(3)与醛反应

氨基酸的α-氨基能与醛类物质反应，生成西佛碱-C=N-西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。赖氨酸的侧链氨基也能反应。氨基还可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物，由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。

(4)与异硫氰酸苯酯(PTC反应）

α-氨基与PITG在弱碱性条件下形成相应的苯氨基碱甲酰衍生物(PTC-AA)，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)。这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸，在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。

(5)磺酰化

氨基酸与5-(二甲胺基)蔡-1-磺酰氯(DNS-CI)反应，生成DNS-氨基酸产物在酸性条件下(6NHCI)100℃也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较灵敏，可用于微量分析。

(6)与DNFB反应

氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸)。这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性100℃高温。该反应曾被英国的Sanger用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫桑格尔试剂。现在应用于蛋白质N-末端测定。

(7)转氨反应

在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。

2.羧基的反应

羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。羧基可与醇生成酯，此反应常用于多肽合成中的羧基保护。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如对硝基苯酯。将氨基保护以后，可与二氨亚碱或五氧化磷作用生成酰氧，在多肽合成中用于活化羧基。在脱羧酶的催化下，可脱去羧基，形成伯胺。

3.茚三酮反应

氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最后生成蓝色物质。而脯氨酸生成黄色化合物。根据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。

4.侧链的反应

丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或苷。

半胱氨酸侧链巯基反应性高:

(1)二硫键(disulfide bond）

半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫键在形成蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可以打开二硫键。在研究蛋白质结构时，氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫键，生成相应的磺酸。还原剂如巯基乙醇、硫基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的巯基化合物。半胱氨酸中的巯基很不稳定，极易氧化，因此利用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氧化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氩汞苯甲酸等试剂与巯基作用，把它保护起来，防止它重新氧化。

(2)烷化

半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。

半胱氨酸与丫丙啶反应，生成带正电的侧链，称为S-氨乙基半胱氨酸。

(3)与重金属反应

极微量的某些重金属离子，如Ag+、Hg2+，就能与疏基反应，生成硫醇盐，导致含疏基的酶失活。

5.以下反应常用于氨基酸的检验:

①酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly反应)，可用于定性、定量测定。组氨酸生成红色的化合物，酪氨酸为桔黄色。

②精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应。用于胍基的鉴定。

③酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，称为米伦反应，是鉴定酚基的特性反应。

4色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会出现紫色环，用于鉴定吲哚基。在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋白质内部，因而反应很慢甚至不反应。

05色谱与氨基酸的分析分离

1.色谱的发展史

最早的层析实验是俄国植物学家在1903年用碳酸钙分离叶绿素，属于吸附层析。40年代出现了分配层析，50年代出现了气相色谱，60年代出现HPLO80年代出现了超临界层析，90年代出现的超微量HPLC可分离ng级的样品。

2.色谱的分类

按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等;

按介质可分为纸层析、薄层层析、柱居析等:

按分离机制可分为吸附层析、分配层析、分子筛层析等。

3.色谱的应用

可用于分离、制各、纯度鉴定等。

定性可通过保留值、内标、标准曲线等方法，定量一般用标准曲线法。

氨基酸的分祈分离是测定蛋白质结构的基础。在分配层析和离子交换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质站构的研究才取得了显著的成就。现在这些方法已自动化。

氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱顺序如下:

Asp，Thr，Ser，Glu，Pro，Gly，Ala，Cys，Val，Met，Ile，Leu，Tyr，Phe，Lys，His，(NH3)，Arg。

3.请判断三肽K-A-G在pH7.0时所带净电荷的情况

当溶液pH大于可解离基团的pKa值时，占优势的离子形式是该侧链基团的共轭碱;

当溶液pH小于可解离基团的pKa值时，占优势的离子形式是该侧链基团的共轭酸。

由该规则，可判断在pH7.0的溶液中α-羧基占优势的离子形式是-COO- ；

α-氨基占优势的离子形式是-NH3+；

ε-氨基占优势的离子形式是-NH3+。

结论:由以上结果可以判断该肽在pH7.0的溶液中占优势的离子形式为[肽+]。

肽01肽键和肽

最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽。肽链中的氦基酸由于形成酞键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为残基。肽的命名是根据组成肽的氨基酸残基来确定的。肽的书写也是从氨基端开始。在肽键中C-N单键具有约40%双键性质，而C=0双键具有40%单键性质。这样就产生两个重要结果:

(1)肽谜的亚氨基在pH0-14的范围内没有明显的解离和质子化的倾向；

(2)肽键中的G一N单键不能自由旋转，使蛋白质能折叠成各种三维构象。除了蛋白质部分水解可以产生各种简单的多肽以外，自然界中还有长短不等的小肽，它们具有特殊的生理功能。

动植物细胞中含有一种三肽，称为谷胱甘肽，即δ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。

因其含有疏基，故常以QSH来表示。它在体内的氧化还原过程中起重要作用。脑啡胀是夫然止痛剂。肌肉中的鹅阮肽是一个二肽，即B-丙氨酰组氨酸。肌肽可作为肌肉中的缓冲剂，缓冲肌肉产生的乳酸对pH的影响。一种驻菊素叫做短杆菊酪胀，由12种氨基酸组成，其中有几种是D-氦基酸。这些天然肱中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。许多激素也是多肽，如催产素、加压素、舒缓激肽等。

02肽的理化性质

小肽的理化性质与氨基酸类似。许多小肽已经结晶。晶体的熔点很高，说明是离子晶体，在水溶液中以偶极离子存在。肽键的亚氨基不解离，所以肽的酸城性取决于肽的末端效基、欺基和侧链上的基团。在长酞或蛋白质中，可解岛的基团主要是侧链上的。肽的滴定曲线和氨基酸的很相似。肽的等电点也可以根据它的pK’值确定。

一般小肽的旋光度等于各个氨基酸旋光度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。肽的化学性质和氨基酸一样，但有一些特殊的反应，如双缩脲反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物都能与CuSO4碱性溶液发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物。利用这个反应可以测定蛋白质的含量。

03常见问题/习题

1.非极性氨基酸和有极性基团的不带电荷氨基酸通过离子交换树脂法分离，先被洗脱的是有极性的氨基酸，为什么?

解答:离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成，极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。由于非极性树脂基体相对固定，与氨基酸之间的疏水作用大小依赖于氨基酸侧链的非极性大小，非极性强的氨基酸与树脂的非极性部分作用力强，因此先被洗脱的是极性强的氨基酸，后被洗脱的是非极性强的氨基酸。

2.有一个四肽Lys-Ser-Asp-Ala，各氨基酸的可解离基团的pKa如下：

Lys：α-氨基8.96，侧链氨基10.79；Asp：侧链羧基3.86；Ala:α-羧基2.34。

请根据这些数据:

(1)确定此四肽的等电点;

(2)推断在pH=4和pH=9时，此肽在电泳时的运动方向(向阳极或阴极)。

(1)解题思路:寡肽等电点的计算方法与氨基酸等电点的计算方法和步骤相似:第一步，写出解离方程;第二步，找到兼性离子;第三步，计算兼性离子两侧两个pKa的平均值，即为等电点。

所以，此四肽等电点pl=(3.86+8.96)/2=6.41

(2)当pH=4时，低于等电点6.41，四肽带正电荷，在电场中移向阴极;

当pH=9时，高于等电点6.41，四肽带负电荷，在电场中移向阳极。

3.请判断三肽K-A-G在pH70时所带净电荷的情况解析：

(1)牢记各种氨基酸的单字母符号。本题中K为Lys，A为AlaG为Gly

(2)找出肽链中可解离的侧链基团。本题肽链中可解离基团有Lys的α-氨基和ε-氨基，Gly的α-羧基。

(3)写解离方程式。

(4)判断肽链的带电情况。

蛋白质01一级结构

蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。

一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从N-天端向C-束端书写。采用三字母符号时,氨基酸之间用连字符(-)隔开。

02一级结构的测定一测定步骤

测定蛋白质的一级结构，要求祥品必须是均一的(纯度大于97%)而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤:

1.通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。

2.将每条肽链分开，并分离提纯。

3.肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。

4.肽链的另一部分样品进行N末端和C末端的鉴定。

5.拆开肽链内部的二硫键。

6.肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并将各个肱段分离出来。

7.测定每个肽段的氨基酸顺序。

8.从第二步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段，其断裂点与第五步不同。分高肽段并测序。比较两套肽段的氦基酸顺序，根据其重叠部分拼凑出整个服链的氨基酸顺序。

9.测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。

03一级结构的测定—末端分析(N末端）

①蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋自质(DNP-蛋白质)。产物黄色，可经受酸性100℃高温。水解时，肽链断开，但DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂(如乙醚)中，这样可与其他氨基酸和é一DNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的DNP氢基酸。

②丹磺酰氨法是更灵敏的方法。蛋白质的末端氨基与-(二甲胺基)萘-1-磺酰氨(DNS-CI)反应，生成DNS-蛋白质。DNS-氢基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比DNFB法灵敏100倍。

③目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯PITC)法。末端氨基与PITG，在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物两从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是刺=剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定析新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪,可测定含20个以上氨基酸的肽段的氦基酸顺序。缺点是不如丹磺砒氯灵敏,可与之结合使用。

④N末端氨基酸也可用酶学方法即氢肽酶法测定。

04一级结构的测定—末端分析(C末端）

1、C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成和应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。有断裂干扰。

2、另一个方法是肼解法。多肽与酰在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。

3、也可用羧肽酶法鉴定。将蛋白质在pH8.0，30°C与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羚p酶B水解精氨酸和赖氨酸。

05一级结构的测定一二硫键的拆开和肽链的分离

一般情况下，蛋白质分子中肽链的数目应等于N末端氨基酸残基的数日，可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。必须设法把这些肽链分离开来，然后测定每条肱链的氨基酸顺序。如果这些肽链之间不是共价交联的。可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。如果肽链之间以二硫键交联，或酞链中含有链内二碱键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的疏基乙醇处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的疏基，防止重新氧化。二硫健拆开后形成的个别肽链，口用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。

06一级结构的测定一肽链的完全水解和氨基酸组成的测定

在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。日前用氨基酸自动分析位2-4小时即可完成。

蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。

07一级结构的测定一肽链的部分水解和肽段的分离

当肽链的氨基酸组成及N末端和C末端已知后，随后的步骤是肽链的部分水解这是测序工作的关键步骤。这一步通常用专一性很强的蛋白酶来完成。

最常用的是胰蛋白酶，它专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生成的肽段之一的C末端是赖氨酸或精氨酸。用丫丙啶处理，可增加酶切位点(半胱氨酸);用马来酸酐(顺丁烯二酸酐)保护赖氢酸的侧链氨基，或用1,2-环己二酮修饰精氨酸的胍基，可减少酶切位点。

经常使用的还有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的段基形成的肽键。其他疏水残基反应较幔。

用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。以上三种方法经常使用。

08一级结构的测定—多肽链中氨基酸顺序的测定

从多肽链中部分水解得到的肽段可用化学法或酶法测序，然后比较用不同方法获得的两套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此重鲁的部分，确定每个肽段的适当位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。

09一级结构的测定—二硫键位置的确定

一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物守分离出含二键谴的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用冒蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用(pH2)，此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pt6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。

将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分高，测序，与多肽链比较，即可确定二疏键位置。

10常见问题/习题

一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应(检测胍基的)呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。

解:胰蛋白酶酶专一水解Lys和Arg残基的羧基参与形成的肽键，故该四肽中含Lys或Arg;一肽段在280nm附近有强光吸收且Pauly反应和坂口反应(检测胍基的)呈阳性，说明该肽段含Tyr和Arg;溴化氰专一断裂Met残基的羧基参加形成的肽键，又因生成了与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故该肽段为-Met-Pro-；所以四肽组成的氨基酸组成为Tyr-Arg-Met-Pro，即 YRMP。