如何证明细胞中有MPF？

892304156

夜空繁昕 发表于 2014-12-7 09:41
细胞！你呢

我也是细胞，，，

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坠天使

再疯狂一次 发表于 2014-12-7 08:42
去呦！终于发出去了！各种被和谐

行啊

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匿名用户

坠天使 发表于 2014-12-7 18:52
行啊

忽悠我，说好的，我发你加的？？？

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坠天使

再疯狂一次 发表于 2014-12-7 23:21
忽悠我，说好的，我发你加的？？？

我没看到你发联系方式啊？

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坠天使

再疯狂一次 发表于 2014-12-8 07:42
12月7号，八点四十一发的，*

好啦

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庸人自扰123

这个题，我书上就有

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892304156

庸人自扰123 发表于 2014-12-10 23:11
这个题，我书上就有

你是说有答案吗？可以给我发一下吗？

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asuka2015

如何证明细胞中有MPF
坠天使的回答：
“将分裂期的胞质注射到间期细胞，引起间期细胞提前进入分裂期。说明胞质中某种因子引起细胞成熟。或者我们用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我们培养的细胞讲不会进入分裂期。”

坠天使的将分裂期的胞质注射到间期细胞的实验设计不能证明分裂期的细胞中的确存在MPF，只能说明分裂期的细胞的胞质中某种因子引起细胞成熟，这没有回答问题所问。
至于用坠天使的设计的“基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我们培养的细胞讲不会进入分裂期”，只能说明被敲除掉的两个基因会影响细胞是否进入分裂期，如果细胞不挂掉的话，即使事先我们能够确定MPF的基因就是这两个基因，我们也不能保证任何细胞周期的目的细胞中就一定会有完整的MPF的存在，因为基因存在，不表示其一定会表达，更不表示起一定会组成型表达。

绝大多数蛋白质在细胞中都会周期性地被替换。细胞内蛋白的降解主要通过两个途径, 即自噬(Autophagy)和泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。自噬的字面上的意思是“自己吃自己”, 它是通过溶酶体和包内体抱过一些蛋白质和细胞器，将其降解，一般具有新陈代谢的功能。自噬是一个在真核生物中高度保守的过程, 它发生在细胞质中, 细胞内过多或异常的细胞器被运输到溶酶体中被降解。而 泛素-蛋白酶体系统 则负责特异性地降解大多数细胞内蛋白, 它是一种高效蛋白降解途径, 其生物学作用非常广泛。在泛素是一个广泛分布在真核细胞中的小分子球状蛋白质,由76 个氨基酸所组成,在序列上高度保守,人与酵母菌的泛素序列仅有3 个氨基酸不同。泛素在一系列酶的催化下,其C - 末端Gly 与靶蛋白的Lys 侧链相连,尔后其他泛素分子以Gly 连接到先前结合的泛素分子的Lys 侧链上而形成多泛素化链。E1酶（活化酶）负责活化泛素蛋白，E2酶（转移酶）通过转硫醇作用从E1酶处获得泛素蛋白，并将其与底物蛋白，然后E3酶(连接酶)将泛素蛋白与底物蛋白质连接在一起。最终泛素蛋白与底物蛋白质的共价复合体（一个底物蛋白质分子可能会连接上几个泛素分子）进入蛋白酶体中被水解为2-5小片段的小肽段释放到细胞质里，再在细胞质里被特定的酶降解为游离的氨基酸分子。
对于本题而言，MPF是一种在G2期形成的能够促进M期启动的调控因子，广泛存在于从酵母到哺乳动物的细胞中，由p34cdc2和cyclin B两种蛋白质组成。p34cdc2是MPF的催化亚基，在整个细胞周期中的表达量较为恒定，cyclin B是MPF的调节亚基，其表达随细胞周期而变化。在G2/M期，MPF活性达到了高峰。MPF活化后表现蛋白激酶活性，能够使多种蛋白质底物磷酸化，促进细胞由G2期进入M期。cyclin B在G1期的晚期即开始表达并且积累，在G2后期含量到达最大值，一直维持到M期阶段，然后迅速降解。所以不是具有cyclin B基因并且该基因能够正常表达的细胞，在每一个细胞周期的不同时相都能够表达cyclin B，也就说，不是每个细胞周期的不同时相都有MPF分子，虽然一般CDK1（ p34cdc2）不缺。
至此，我们知道了MPF是包括了p34cdc2和cyclin B两个亚基组成的蛋白质。要想证明细胞中存在完整的MPF，首先应该选择G2期的细胞，此时cyclin B比较丰富，然后粉碎细胞，提取出完整的MPF，并且鉴定MPF。
如果我们能够在先用其他试验方法证明了没有其他蛋白质同样起到了MPF的功能，如果能够排除其他的蛋白质的同样的生物功能或者与MPF存在相互作用而形成相互作用的蛋白质网络的话，坠天使的回答的两种试验技术可以作为检测MPF的生物功能的两种可能的试验方法，而且基因敲除的方法不一定能够一定会在细胞表型上体现出来。

一般蛋白质的分离纯化的一般顺序是：粉碎细胞或提取含有提取分泌到细胞外的表达产物的培养基、沉淀、过滤、初步浓缩（比如超滤）、中间纯化操作、最后采用高分辨率的纯化方法进行分离纯化、产物鉴定和保存。
第一步，样品处理和粗分离。粉碎细胞或提取含有提取分泌到细胞外的表达产物的培养基、沉淀、过滤、初步浓缩（比如超滤）一般也叫粗分离。因为我们知道MPF是在分裂期才必定完整地存在，所以应该选取分裂期的细胞加以破碎、抽提、分级分离，保留下细胞质。
第二步，中间纯化。中间纯化阶段一般是利用蛋白质的分子量、形状、电荷性质、等电点、疏水性、密度、与配体的结合能力、与金属的结合能力、与有机小分子（比如某些、染料分子）的结合能力等特性进行蛋白质产物的分离提纯。中间纯化的实验操作普遍地包括各种层析方法，比如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、金属螯合层析、等电点聚焦、凝胶过滤层析等，也包括离心、透析、超滤等其他操作穿插其间，不过一般没有电泳，特别是在大规模分离提纯蛋白质时。各种层析方法，比如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、等电点聚焦、凝胶过滤层析、金属螯合层析等在中间分离纯化阶段没有完全固定的顺序，虽然一般处理比较大量的样品时，离子交换层析、疏水层析一般先使用，但是有时在凝胶层析之后也可能会用到离子交换层析、疏水层析，比较普遍的情况而言，亲和层析、金属螯合层析不会首先在中间分离阶段的初始时期及使用。中间纯化步骤比较多的是首先使用离子交换层析和疏水层析，而后根据具体情况，可使用等电点聚焦、凝胶过滤层析等其他的层析方法，离心、透析、超滤等其他操作根据需要而穿插其间。再往后可以用亲和层析和金属螯合层析，不要把亲和层析和金属螯合层析一开始就在中间纯化阶段使用，因为样品溶液中的杂质太多，会干扰受体-配体的专一性结合。目的蛋白质中的DNA、多糖、脂类等非蛋白质成分在中间分离纯化阶段必须要考虑认真去除，虽然粗分离阶段已经能够去掉相当多的非蛋白质的杂质成分。DNA可以用离子交换层析去除，多糖可以用凝集素亲和层析去除。理论上将可以用酶水解掉多糖和DNA，然后通过分子筛层析柱而对两者的降解产物进行去除，但是用于购买酶的费用增加成本太多，而且又加入需要分离纯化处理的新的杂蛋白，所以此种分离纯化方案不可行。脂类可以通过分子筛层析而与蛋白质分离。对于分离出MPF一般可以用凝胶层析，这样容易分离出p34cdc2和cyclin B两个亚基缔合而成的完整的MPF，只要依据已知的完整的MPF的分子量即可以提存MPF。
第三步是精细分离纯化。精细分离纯化一般是用亲和层析、凝胶过滤层析和HPLC，这样可以依靠蛋白质的分子量的差别得到比较纯的目的蛋白质产物，而且能够去盐和有机小分子，HPLC过早使用效果不好，杂质过多可能会堵住柱内的填充介质。亲和层析和金属螯合层析也可以用于蛋白质的精细分离纯化，但是之后一般要用。
这三步结束时，一般目的蛋白质样品的浓度会有所降低，而且会有非缓冲溶液的其他的洗脱液（尤其是在反相HPLC、亲和层析和金属螯合层析等操作积累的盐或有机小分子），所以有必要用透析、超滤去除小分子和适当浓缩，以利用产物检测和保存。
对于问题，可以用抗CDK1的单克隆抗体或抗周期蛋白B的单克隆抗体制备成的亲和层析柱进行提纯MFP，有条件的话可以用HPLC亲和柱。

第四步，产物鉴定。对于本问题就是检测我们提取出的目的蛋白质的种类或者身份。提取出的目的蛋白质的身份的一种最直接的检测方法是直接测定蛋白质或者组成亚基的氨基酸组成和亚基的个数。用基于Edman降解法的自动多肽测序仪能够比较容易测定出蛋白质或者组成亚基的氨基酸组成，亚基个数用质谱和SDS PAGE电泳很容易测定出来。
提取出的目的蛋白质的身份的检测的另一个方法是检测被提取的蛋白质得生物功能，而不进行被提取的蛋白质测序（毕竟要有些花费）。可以将分裂期的胞质注射到间期细胞，引起间期细胞提前进入分裂期，说明胞质中某种因子引起细胞成熟，因为我们注入间期细胞了MPF而引起其进入了分裂期，所以证明我们从分裂期细胞提取出来的蛋白质的确是MPF。     
如果有标准品MPF的相关数据的话，也可以通过用红外傅里叶光谱、紫外光谱、圆二色光谱、SDS-PAGE HPLC、质谱、生物功能、肽谱分析等检测技术将被提取的MPF与标准品MPF进行对比而对提取的蛋白质进行身份判别。
被提取的蛋白质得生物功能的检测方法可以使用基因敲除。但是敲除前先要确定：被提取的蛋白质的氨基酸序列，并且从氨基酸序列推出基因序列，再确定此基因就是MPF的两个亚基的基因，然后才能确定基因敲除的具体的基因。但是既然能够用多种方法已经能够确定了被提取的蛋白质就是MPF，那么基因敲除就没有必要在做了。除非，题目要求我们必须再用试验方法检测MPF的生物功能。而且即使非要去检测MPF的生物功能也不一定非要用到基因敲除。
因为基因敲除的试验方法，相比较直接提取M其细胞内的MPF的工作量一般来说要大，没有必要一定使用，而且不能保证敲除掉细胞的CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因后，该种细胞一定能够存活下来，所以不如向细胞内注入抗CDK1的单克隆抗体或抗周期蛋白B的单克隆抗体，观测细胞能不能进入分裂期，而且可以分别分梯度地用显微注射方法注入抗CDK1的单克隆抗体或抗周期蛋白B的单克隆抗体进入细胞，再对细胞加以培养并且诱导细胞进入分裂期，用没有做单克隆抗体显微注射处理的同种细胞在同样条件下培养并且诱导进入分裂期，作为阴性对照。
如果要用实验方法去检测MPF的生物功能也可以用特异性引发CDK1基因和周期蛋白B沉默的siRNA、miRNA导入细胞，抑制CDK1基因和周期蛋白B基因的表达，再对细胞加以培养并且诱导细胞进入分裂期，并且观测细胞是否能够进入分裂期。用没有做siRNA、miRNA导入的同种细胞在同样条件下培养并且诱导进入分裂期，作为阴性对照。
因此推荐使用siRNA、miRNA和单克隆抗体抑制细胞内的CDK1和周期蛋白B的数量和活性，是因为这样不会完全抑制CDK1和周期蛋白B的表达，不至于使细胞难以承受而死亡，细胞挂了，那么又如何检测出我们提取的蛋白质是不是MPF哪？另外，用siRNA、miRNA和单克隆抗体抑制细胞内的CDK1和周期蛋白B的数量和活性可以分梯度进行，并非不可以逆转，细胞不会挂掉，还可以留作其他实验。

asuka2015

我把解答切成几部分发上来！

坠天使的回答：
“将分裂期的胞质注射到间期细胞，引起间期细胞提前进入分裂期。说明胞质中某种因子引起细胞成熟。或者我们用基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我们培养的细胞讲不会进入分裂期。”

坠天使的将分裂期的胞质注射到间期细胞的实验设计不能证明分裂期的细胞中的确存在MPF，只能说明分裂期的细胞的胞质中某种因子引起细胞成熟，这没有回答问题所问。
至于用坠天使的设计的“基因敲除的方法敲掉CDK1的基因，或者周期蛋白B的基因，我们培养的细胞讲不会进入分裂期”，只能说明被敲除掉的两个基因会影响细胞是否进入分裂期，如果细胞不挂掉的话，即使事先我们能够确定MPF的基因就是这两个基因，我们也不能保证任何细胞周期的目的细胞中就一定会有完整的MPF的存在，因为基因存在，不表示其一定会表达，更不表示起一定会组成型表达。

绝大多数蛋白质在细胞中都会周期性地被替换。细胞内蛋白的降解主要通过两个途径, 即自噬(Autophagy)和泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。自噬的字面上的意思是“自己吃自己”, 它是通过溶酶体和包内体抱过一些蛋白质和细胞器，将其降解，一般具有新陈代谢的功能。自噬是一个在真核生物中高度保守的过程, 它发生在细胞质中, 细胞内过多或异常的细胞器被运输到溶酶体中被降解。而 泛素-蛋白酶体系统 则负责特异性地降解大多数细胞内蛋白, 它是一种高效蛋白降解途径, 其生物学作用非常广泛。在泛素是一个广泛分布在真核细胞中的小分子球状蛋白质,由76 个氨基酸所组成,在序列上高度保守,人与酵母菌的泛素序列仅有3 个氨基酸不同。泛素在一系列酶的催化下,其C - 末端Gly 与靶蛋白的Lys 侧链相连,尔后其他泛素分子以Gly 连接到先前结合的泛素分子的Lys 侧链上而形成多泛素化链。E1酶（活化酶）负责活化泛素蛋白，E2酶（转移酶）通过转硫醇作用从E1酶处获得泛素蛋白，并将其与底物蛋白，然后E3酶(连接酶)将泛素蛋白与底物蛋白质连接在一起。最终泛素蛋白与底物蛋白质的共价复合体（一个底物蛋白质分子可能会连接上几个泛素分子）进入蛋白酶体中被水解为2-5小片段的小肽段释放到细胞质里，再在细胞质里被特定的酶降解为游离的氨基酸分子。

asuka2015

没有想到今天审查帖子通过还挺快！那我就再解答一些大的生物学试题。