一道生化真题求解

Burning_2012

设计相关实验检测病人血清中是否存在HBV的DNA？请问是用荧光定量PCR还是用Southern 另求大概步骤谢谢~

asuka2013

方法有很多种，不过这里不是分子生物学实验技术论坛或者病毒学技术论坛，我只告诉你答在考卷上能够得分的你看完比较容易记住的就行了。{:soso_e113:}
问题回答分为两部分，第一部分了解一些即可(DNA提取说一句），答卷时不必答出。第二部分要回答出来( 具体试剂不必回答，只要说出大致步骤）。
第一部分，DNA提取与限制性内切酶切割DNA
第一步，先从血液中提取出全部非细胞的DNA，不需要粉碎细胞。
第二步，检测血液中的乙肝病毒（HBV）。乙肝病毒（HBV），未经限制性内切酶作用是环状DNA（有些地方只有单链DNA).所以呈现松弛型以及超螺旋形两种形式。如果用EcoR I 切割后会形成一个约3.2KD的直线型DNA，琼脂糖凝胶电泳时会介于HBV的松弛型以及超螺旋形两种形式的电泳带之间，这能够从电泳带上读出各带的相对分子量。琼脂糖凝胶电泳显示的3.2KDKD的直线型DNA的带，说明了 检测血液中的乙肝病毒（HBV）有为整合进入肝细胞的染色体DNA的情况存在。
第三步，如果琼脂糖凝胶电泳显示的3.2KDKD的直线型DNA的之外还有两个明显的分子量小于琼脂糖凝胶电泳显示的3.2KDKD的直线型DNA的带存在且介于HBV的松弛型以及超螺旋形两种形式的电泳带之间，那么应该再做一个Hind III切割的产生的大于3.2KDKD的直线型DNA的带存在且它们介于HBV的松弛型以及超螺旋形两种形式的电泳带之间，这时基本上可以确定乙肝病毒（HBV）已经整合进入了患者的肝细胞DNA中。
第二部分Southern Boltting
1.酶切和电泳。Southern Boltting用限制性内切酶切割DNA在经过电泳分离后，将琼脂糖胶泡入0.25M的盐酸溶液约15分钟去掉部分嘌呤，并且得到较小的DNA片段。之后用蒸馏水洗去盐酸，再以0.5MNaOH作用约15分钟，以破坏双链DNA的氢键，然后用蒸馏水洗去NaOH。因为DNA带负电荷，所以要用正电荷加以中和，否则DNA单链也无法与同样带有负电荷的DNA单链相互作用，即用蒸馏水洗去NaOH即加入1.5MNaCl/溶液1mMTrisl-HCl缓冲溶液（把琼脂糖胶泡进1.5MNaC溶液/1mMTrisl-HCl缓冲溶液)，以便中和DNA的负电荷，大概15到20分钟。
2.琼脂糖胶的DNA转移到固体支持物上。然后取出琼脂糖胶用蒸馏水冲洗后，将琼脂糖胶的DNA转移到硝酸纤维膜上。转移可用毛细现象，也可以通电或者从真空法，反正胶与膜要紧密接触。现在有专门的Southern Boltting转移仪器。
3.探针标记。这里的探针是乙肝病毒单链DNA片段，用放射性元素或者地高辛标记。导入放射性元素可用32P，用随机引物法货切口平移法或末端标记法导入DNA片段。碱性磷酸酶能够移除5‘-P形成羟基，再由激酶加在羟基上形成32P，以y-32P-ATP为原料。这一步也可用荧光定量PCR以引物延伸法给乙肝病毒单链DNA片段加入32P，构成探针。地高辛标记更容易一些，直接地高辛配集-11-dUTP，也就是与dUTP共价链接上地高辛分子作为标记物，因为大多数DNA聚合酶不能识别dUTP与dTTP，所以地高辛配集-11-dUTP被参入到乙肝病毒单链DNA片段构成探针。
4.分子杂交。
5。检测。
字太多了，你自己看看生物化学书，记住简单原理就行了

asuka2013

论坛还把我给此题贴的英文资料给删除了！