分子生物学教案

成天乐

第一章：分子生物学绪论
一、分子生物学的基本含义
分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、分子生物学的主要研究内容
分子生物学主要包含以下三部分研究内容
1、结构分子生物学：
    是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。他包扩结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。
2、基因表达与调控
基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译；在个体发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调控），并随着内外环境的变化而不断的加以修正（环境调控）。原核基因的表达调控主要发生在转录水平，真核基因的表达调控可发生在以下三个方面：信号转导、转录因子、RNA剪辑。
3、DNA重组技术：
是将不同的DN**段（如基因或基因的一部分）按照人们的设计定向的连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
    DNA重组技术也称为基因克隆或者分子克隆，它实际上包括了一系列的实验技术，最终目的是把一个生物体中的遗传信息(DNA)转入另一个生物体。
三、分子生物学与其他学科的关系
分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生命活动一致性，使得生物学将是在生物学范围内所有学科在分子水平上的统一。
四、分子生物学的发展过程
分子生物学的发展大致可分为三个阶段。
（一）准备和酝酿阶段
1、确定了蛋白质是生命的主要物质基础
19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，并证明酶的本质是蛋白质。
1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。
1953年Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子-胰岛素A链和B链的氨基酸全序列分析。
2、确定了生物遗传的物质是DNA而不是Pr
证明DNA是遗传物质的两个关键性实验：首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国的微生物学家A*ery.他的实验是用肺炎球菌感染小鼠。美国遗传学家Hershey用T2噬菌体感染大肠杆菌实验，也证明DNA是遗传物质。这两个实验中主要的论点证据是：生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。
（二）现代分子生物学的建立和发展阶段
1956年A.Kornbery以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。
1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl提出并证明DNA半保留复制模型。1968年Okazaki(冈畸)提出DNA不连续复制模型。1972年证实DNA复制开始需要RNA作为引物。
（三）认识并开始改造生命的发展阶段
1、重组DNA技术的建立和发展
1）分子生物学理论和技术的发展阶段
*70年R.Yuan和H.O.Smith发现限制性内切酶
*72年Bery等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功
*77年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒
*79年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素
2）转基因动植物的成功
1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核，得到比原小鼠个体大几倍的”巨鼠“ 我国将生长激素基因转入鱼受精卵，得到转基因鱼，导入了凝血因子IX基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子IX，能有效地用于血友病治疗。
94年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿。
96年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，我国将蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。
2、基因诊断与基因治疗在医学领域的发展
对遗传疾病的治疗，使变异基因和异常表达的基因变为正常基因，从根本上治愈遗传疾病，这就是基因治疗的基本思想。
1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。
1994我国用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。
3.基因组研究的发展
目前分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。
77年Sanger测定了ΦX174全部5375个核苷酸的序列；78年Fiers等测出SV-40全部5224对硷基序列；80年代λ噬菌体48,502硷基对的序列全部测出；96年测出了大肠杆菌4x106硷基对序列；90年人类基因组计划（HumanGenomeProject）开始实施，测定出人基因组全部3x109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因的一级结构。
4.单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展
75年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。80年代以后随着基因工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体等为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。
5.细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域
Sutherland1957年发现cAMP、1965年提出第二信使学说。77年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，将G蛋白与cAMP的作用相联系起来，对G蛋白偶联信号转导途径有了新的认识。随后蛋白酪氨酸激酶途径的发现、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究有了长足的进步。对细胞中的信号转导途径已经形成了基本的概念
五、分子生物学在农业中的应用
改良作物品质：提高蛋白质含量和氨基酸组成；提高植物的抗逆性：抗旱、抗寒、抗病、盐碱。生物农药：生物杀虫剂Bt毒蛋白基因；水果的保鲜：通过反义基因抑制乙烯基因表达；改变花色、花期：对色素基因的改造来改变花的颜色；调控植物激素基因的表达控制花期；转基因动、植物作为生物反应器生产药用蛋白：转基因牛、烟草；转基因猪生产人血红蛋白；转基因羊：澳大利亚、新西兰生产彩色羊毛。
六、现代生物技术的社会伦理问题
新物种的产生：转基因动植物病毒所带来的未知后果，生物武器等，受到素食者的反对：种族歧视的借口：96年从白种人的基因组中分离出抗HIV（爱滋病）基因，其他人种中迄今没有发现该基因的同源序列。性别检测与克隆人：已有法律约束，但可以利用胚胎干细胞培育人体所需的器官。
第二章：DNA的结构与功能
一、DNA的一级结构
1953年Watson和Crick创立的DNA双螺旋结构模型，阐明了DNA分子的结构特征，提出DNA是遗传分子。DNA的一级结构：是指4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了DNA分子的化学构成。四种脱氧核糖核苷酸分别表示为：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP。DNA分子是由这四种不同的脱氧核苷酸，通过3，5-磷酸二酯键连接而成的直链分子。
1．DNA分子的多样性：组成DNA分子的碱基虽然只有四种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，而构成了DNA分子的多样性。如：某一DNA分子是由100个bp组成，它们的可能排列方式就是4100。实际上DNA链中的碱基数远远超出100个，所以，它们的排列方式几乎是无限的。即生物的多样性。因此，DNA中的碱基排列顺序是DNA分子的重要属性。对一种DNA属性的最基本了解就是测定其碱基的排列顺序一级结构。
二、DNA的物理图谱
DNA的物理图谱：是DNA分子的限制性内切酶酶解片段的排列顺序，也就是在DN**段上标记出限制性内切酶的位点顺序。假设有一段DN**段为2450bp，分别有两个XbaI和两个PstI位点，这样每一个单酶切会把此DNA分子切成3个片段，双酶切将产生5个片段。
三、DNA一级结构的测定
双脱氧末端终止法-----Sanger法：原理是采用核苷酸链终止剂—2ˊ,3ˊ--双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ--ddNTP）终止DNA的延长。由于它缺少形成3ˊ,5ˊ--磷酸二脂键所需要的3ˊ-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DN**段DNA序列分析。方法：在A, C, G, T 四种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应后，生成具有相同的5末端，而3ˊ端不同的DN**段混合物，经电泳分析后可以从放射自显影上读出DNA序列。
四、DNA的双螺旋结构
Watson和Crick于1953年根据DNA纤维X射线晶体衍射图及其它试验资料，提出了DNA为右手双螺旋结构的科学假设，随后证明他们提出的DNA构象是DNA分子最为常见的结构，通常称为B型DNA。而DNA分子的结构不是固定不变的，在不同的环境因素，都可促使DNA分子形成不同的构象。通常情况下可分为两大类：一类是右手螺旋，如、B-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、A-DNA；另一类是局部的左手螺旋，即Z-DNA。
B-DNA、A-DNA、Z-DNA的主要区别：
1、A-DNA更紧密，每个碱基平面距离为0.256nm，每圈螺旋有11对碱基，螺距为2.8nm；B-DNA碱基距离为0.338nm，每圈螺旋有10对碱基，螺距为3.4nm。
2、C和G之间核苷酸中脱氧核糖的折叠不同，A-DNA是C3’在内，B-DNA是C2’在内。
3、B-DNA大沟、小沟的深度基本是一致的，只是大沟较宽；A-DNA大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。
4、Z-DNA糖-磷酸主链的走向呈“之”字形，分子呈左手螺旋构象。
5、 Z-DNA较B-DNA细而舒展，螺旋直径为1.8nm，每个碱基平面距离是0.37nm，每圈含12对碱基，螺距为4.5nm。
6、Z-DNA是C3’在内与A-DNA相同。
7、Z-DNA仅有一条小沟，且较深，含有较高的负电荷密度。
   Z－DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。
五、DNA的三股螺旋结构
DNA三股螺旋结构概念是在1957年提出来得，至1987年在质粒的酸性溶液中发现了分子内的三股螺旋DNA，将此种构型的DNA称为H-DNA。它是双螺旋DNA分子中一条链的某一节段，通过链的折叠与同一分子中DNA嘌呤嘧啶双螺旋（其中一条链只有嘌呤AG，另一条链只有嘧啶CT）节段结合而形成的。DNA形成一种分子间的三股螺旋DNA，从而可在转录水平上阻止基因的转录。这就是反基因策略，或称反基因技术。
六、DNA超螺旋结构
超螺旋结构是DNA分子高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两类，一般DNA双螺旋结构中每圈是10个bp ，大于或小于10会出现正或负超螺旋结构，环状DNA分子常以超螺旋结构存在，并以负超螺旋为主，有利于转录的起始。
七、核小体与染色体
核小体：DNA双螺旋链,等距离缠绕组蛋白(H2A、H2B、H3、 H4)各二分子组成八聚体形成众多核心颗粒, 外绕1.75圈左走向的DNA链,每圈约85bpDNA,各颗粒之间为带有H1组蛋白的连接区DNA。
1、组蛋白特征
进化上极端保守性：不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的。无组织特异性：仅有鸟类、鱼类、两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5。钛链上氨基酸分布的不均匀性：碱性氨基酸集中分布在N端，而大部分疏水基团分布在C端。组蛋白的修饰作用包括：甲基化、乙酰化、磷酸化，富含赖氨酸和精氨酸：H5还富含丙氨酸、丝氨酸。
2、非组蛋白
HMG蛋白（High Mobility Group Protein)：分子量小3x104以下电泳迁移快而得名，易用低盐溶液0.35mol抽提，其功能可能与DNA的超螺旋结构有关。DNA结合蛋白：是一些与DNA复制或转录有关的酶或调节物质，需用2molNaCl和5mol尿素才能解离。
A24非组蛋白：用0.2mol硫酸从小鼠肝脏中分离得到，位于核小体内，功能不详。
八、DNA结构的不均一性
反向重复序列(in*erted repeats)又称回文序列(palindrome)，它能在DNA或RNA中形成发夹结构。这种回文结构通常是作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶及调节蛋白的识别位点，转录终止信号等。富含A/T的序列：在很多有重要调节功能的DNA区段都富含A•T 特别是在复制起点和启动子的Pribnow框(真核生物为TATA框)的序列中，其对于复制和起始十分重要。因为A－T对只有二条氢键，此处的双链较G－C对处易于解开，有利于起始复合物的形成。
九、DNA的变性、复性和分子杂交
1、DNA的变性（denaturation）：在加热、碱性等条件下，A-T,G-C氢键断裂，形成单链结构。DNA在溶液中发生变性伴随着一系列理、化性质的改变。紫外吸收强度增加；溶液粘度降低；沉降速度增加等。紫外吸收强度的增加与变性（解链）程度成正比；DNA的热变性常称为DNA的“融解”，解链曲线的中点所示的温度称为Tm或称为融点，Tm表示使50% DNA分子解链的温度。不同种类DNA有不同的解链曲线，也有不同的Tm，Tm随（G + C）%含量呈线性增加。
2、DNA的复性：去除变性条件后，DNA可以回复成双链结构，恢复原有的物理化学特征和生物学活性，称为DNA复性（renaturation）。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。
3、核酸的分子杂交：用放射性同位素或荧光素及其他物质标记的已知核酸片段或寡聚核苷酸作为探针，借助探针探测分析未知的核酸样品。称为Southern印迹分析。
Northern印迹分析：根据Southern的原理，用已知DNA作探针，分析检测RNA的方法。
菌落或噬菌斑原位杂交：将硝酸纤维素膜置于布满细菌菌落或噬菌斑的平板上，使平板上每一菌落的一些细菌或噬菌斑的一些DNA粘到硝酸纤维素膜上，形成平板的一个复制品，然后用碱处理，让细菌裂解，DNA变性，就在原位固定于硝酸纤维素膜上，再进行分子杂交。
十、基因与基因组
基因：一般是指表达一种蛋白质或功能RNA的遗传物质的基本单位。
基因组：是指某种生物所包含的全套基因。如：原核生物结构简单只有一个染色体，所有的基因都在这条染色体上，即构成该生物的基因组。随着生物的进化基因组的数值（基因组C值）随之增加，人类的基因组是包含在23对染色体中的所有基因，其单倍体基因组的C值在3 x 109 bp；病毒含103~105bp；细菌含105~107bp。
基因与蛋白质：假定平均以1000bp(1kb)编码一个蛋白质，最小的病毒可含4~5个基因；大肠杆菌含3000~4000个基因；而高等生物的染色体则可含有10万个以上基因。按理论计算人类应有200~300万个基因（3 x 109 bp )，实际只有10万个左右，因为含有非编码序列和隔离序列及尚不知功能序列；病毒的基因数要比计算所得的大，因有基因重叠现象。
（一）、原核基因组
原核基因组主要包括病毒基因组和属于原核生物的细菌基因组。
1、病毒基因组：病毒（包括噬菌体）DNA分子是最小的，最小的病毒基因组仅有5kb左右，最大的有200kb左右。有些病毒的基因组不够编码自己的蛋白质，如φx174要编码9个蛋白质(至少需要9kb)，而基因组仅有5kb左右，为解决这一矛盾，就出现了基因重叠现象，如A基因和B基因的重叠：
2、细菌基因组：细菌基因组含有染色体和染色体外的DNA—质粒。质粒（plasmid）：是独立于染色体之外的双链环状DNA分子，含有遗传信息能进行自主复制，并传至子代细胞，小的质粒仅有几个kb，大的有500kb，每个质粒*一段DNA复制起始位点的序列，用于克隆的载体。
1）质粒的特点
a. 是染色质外的双链共价闭合环形DNA（co*alently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的质粒比较容易分离纯化，＞15kb的质粒则不易提取。
b. 能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。
c. 每个质粒DNA上*复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制。
d.  质粒对宿主生存并不是必需的
e. 细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因。
如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐氰霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。细菌的抗药性，常与R质粒在细菌间的传播有关，F质粒能促使这种传递。分子生物学使用的质粒载体是经过了许多的人工的改造。如：pBR322及pUC*。
2) 细菌基因组的结构特征
a. 功能上相关的基因串联在一起组成操纵子结构，受同一个启动子调控，几个基因转录在同一条mRNA上，形成多顺反子mRNA。
b. 基因组中不存在内含子，基因是连续的。不存在不连续基因，转录后无须进行加工修饰，直接可以翻译。
c. 基因组的大部分是编码区，只有小部分是非翻译区，其中包括调控部分。
d. 少数基因有基因重叠现象。
（二）、真核基因组
真核基因组结构特征：真核基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，在脊椎动物中90%左右是非编码序列，而且编码序列大多数被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，称为割裂基因，非编码的内含子则存在广泛的序列变异，说明内含子中的大部分序列是无功能的。
1、重复序列：
   在DNA中有一段碱基序列多次重复出现。根据重复出现的次数可分为：高度重复序列、中度重复序列、单拷贝基因。
1）高度重复序列：
一般由较短的序列组成，常集中在一起，串联排列，重复次数可高达几百万次。将这种高度重复序列常称为卫星DNA 。在真核基因组DNA中的G ：C碱基对的分布与细菌中不同，是不均一的，由于有这种碱基组分分布的不均一，在CsCl等密度剃度超离心分离后，出现一个主峰和1~2个小峰，这种小峰对主峰而言尤似主峰的卫星，所以称卫星DNA，它是多种短重复序列的混合物，人们按照重复序列的长短将卫星DNA分成3类：a、卫星DNA：重复序列长度在100bp左右，主要存在于异染色体近中心粒和端粒，在人群中多态性不强。b、小卫星DNA：重复序列长度在15~70bp，主要存在于常染色体中，在人群中有高度多态性。 c、微卫星DNA：重复序列长度在2~6bp，但串联起来的总长度有高度变化，这种长度的多态性是由于精卵结合在减数分裂过程中发生不相等的交叉重复造成的，使它的长度在每一个个体中就有差别，这是进行DNA指纹分析的基础。
2）中度重复序列：这类重复序列的重复次数在10~104bp之间。如各种rRNA、tRNA等基因属于这一类。
3）、单拷贝基因：基因组中仅出现一次的基因称为单拷贝基因。
2、基因割裂现象：单拷贝基因都是编码蛋白质的基因，大多数不连续的，即基因内部含有非编码序列---内含子，和编码部分----外显子，这种割裂基因是真核生物的普遍现象。内含子有一个共同的特征：5/ 端以GT开始，3/ 端以AG结束，称为GT/AG规则。
3、一个基因编码两种以上的mRNA：在原核生物中，由于相关基因串联在一起构成操纵子，产生多顺反子mRNA，翻译出多种蛋白质。在真核生物中没有操纵子结构，每个基因都单独构成一个转录单位，产生单顺反子mRNA，仅编码一种蛋白质。编码两种以上的mRNA主要是通过拼接方式来完成的。
4、基因家族：来自一个祖先基因，通过扩增形成多个结构和功能相关的基因，称为~。所编码的蛋白质是同源的。如：组蛋白基因家族，有5个成员，即HI、H2A、H2B、H3、H4。
5、假基因：来源同一个祖先基因但不具有转录功能，不能产生有功能的mRNA。而这些尚失功能的扩增基因仍留在基因家族中，这种基因称为~。不具内含子，推测可能来源于cDNA 。
6、限制性片段长度多态性：（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP）DNA 顺序发生了突变，使突变所在部位的某种限制性内切酶的位点发生改变。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与正常不同的限制性片段。这样，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型。
第三章DNA的复制
一、DNA复制的方式及一般过程：
(一) DNA的半保留复制(semiconser*ati*e replication)
Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。
半保留复制的实验依据：1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有15N标记的培养基中培养得到15N DNA。然后将15N DNA细菌转移到含有14N标记的培养基中进行培养在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心观察DNA所处的位置（见图3-4、3-5）由于15N DNA的密度比14N DNA的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。
半保留复制的实验结果：在全部由15N标记的培养基中得到的15N DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N DNA和14N -DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N 14N －DNA和14N -DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱。
半保留复制进一步的实验证椐：为证实第一代杂交分子确实是一半15N DNA－半14N DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N DNA)及低密度带(14N DNA)。它们的实验只有用半保留复制理论才能得到圆满的解释。
（二）DNA复制的一般过程：
DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形成一个复制叉或复制泡，两条单链分别做模板，各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是5′→3′方向，另一条链的走向是3′→5′方向，但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链(leadingstrand)，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的。而另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随从链(lagging strand)，随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制(图3-7)。
二、DNA复制过程的三个阶段
第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成。第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。第三阶段为DNA复制的终止阶段。
（一）DNA复制的起始阶段：
复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originof replication)常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中只有一个复制起始点，即有一个复制子。在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有许多个复制子。
1、DNA复制起始点的结构特性：大肠杆菌复制起始点Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。有些生物复制起始点Ori是富含A•T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。
2、DNA复制的方向性：(1)定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡； (2)定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉(replication fork)。(3)两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。
3、DNA复制的起始：DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的。DNA解链酶：能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）：能保证解开的双链保持单链结构，但不起解链作用。RNA聚合酶：合成RNA引物，再由DNA聚合酶合成新的DNA链。对于随从链是由引发体来完成的，引发体由6种蛋白组成：n、n/、n”、DnaB、C、I。
（二）DNA链的延长
DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程
这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它们在DNA复制中的作用。
1、DNA聚合酶：1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNA polymerase Ⅰ,简写DNA polⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNApolⅡ,DNA polⅢ)，实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNA polⅢ起作用，而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。
DNA聚合酶的共同性质：①需要DNA模板；②需要RNA做为引物；③催化dNTP加到引物的3′-OH末端，因而DNA合成的方向是5′→3′；④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。DNA聚合酶Ⅰ和II主要起到修复DNA和复制的准确性中发挥作用；DNA聚合酶III是DNA复制链延长反应中的主导聚合酶。真核生物DNA聚合酶：真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。复制中起主要作用的是DNA polα。DNA polβ与DNA修复有关。DNA polγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNA polδ前导链的合成靠DNA polδ催化，并且还需要一种细胞周期调节因子（proliferating cell nucleus antigen, PCNA)参与而随从链的合成靠DNA polα和引发酶配合作用完成。
2、与超螺旋松驰有关的酶：拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。
（三）DNA复制的终止阶段
DNA合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由许多相邻的片段，在连接酶的催化下，以3′、5′－磷酸二酯键相连接成为一条长链。连接反应中的能量来自ATP(或NAD＋)。大肠杆菌染色体DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制。真核与原核生物DNA复制的特点：真核生物DNA复制有许多起始点，原核生物只有一个，真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始，而原核生物复制起始点上可以连续开始新的DNA复制。真核生物DNA聚合酶主要以α、β、γ三种酶为主，α是关键酶，一般不具有外切酶活性。真核生物线性DNA末端具有端粒结构。端粒的结构：是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，一般由多个串联在一起的短寡核苷酸（5-8bp）序列组成。5 /-（TxGy）n；3/-(AxCy)n；其中x，y是碱基数，一般在1-4范围内。n是短寡核苷酸序列的重复次数，可以多达数千次。人的端粒DNA约5-15 kb。端粒的功能：保证线性DNA的完整复制；保护染色体末端不受核酸酶水解和不发生染色体的异常重组；决定细胞的寿命，体细胞端粒酶活性低。随着复制次数的增加端粒DNA逐步缩短，细胞逐渐停止分裂，而进入凋亡。恶性肿瘤细胞可表达端粒酶，永生分裂。端粒DNA的合成：真核生物体内都存在一种特殊的反转录酶叫做端粒酶(telomerase)。它是由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′OH末端延长DNA。再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链形成端粒结构三、反转录作用(re*erse transcription)，1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为模板合成DNA称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(re*erse transcriptase)。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。
1、反转录酶的催化作用：反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′OH末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)。
它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。
2、反转录酶的特点：①RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，RNA为引物（多为色氨酸tRNA）催化dNTP聚合。不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H（水解酶）活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以cDNA为模板以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。此外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。
3、反转录酶发现的意义：反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
三、基因重组和基因移动：
基因重组：通过各种途径，使一个基因的DNA序列来源于两个或两个以上亲本DNA的序列，称为基因重组。
基因移动：基因从一处移动到另一处，称为基因移动。可移动基因一般通过转座子形式进行移动。几乎所有生物细胞中都存在可移动基因。
基因重组和基因移动是生物进化的动力，具有重要的生物学意义。
1、基因重组
同源重组：是任何具有一段同源序列的两个基因DNA序列之间的交换。
发生同源重组的条件：两个DNA分子之间存在同源序列，而且同源区序列越长，重组发生率越高，同源区序列太短，很难发生重组。
位点特异性重组：与同源重组不同，它发生在位点特异的短序列区。如λ噬菌体重组特异位点和大肠杆菌重组特异位点有15bp的序列是相同的：GCTTTTTTATACTAA                        
2、基因移动
插入序列（insertion sequence，IS）也称简单转座子，仅含有转作所需的序列和促进转座过程的蛋白（如转座酶）基因。每一种IS元件*不同的序列，但有一些共同的特征：它们都是短序列（约1kb)，两端是短的反向重复序列
转座子（Transposon,Tn）：也称复合转座子，除了含有转座所需序列和转座酶基因以外，在中心区还有其它基因，常是抗生素抗性基因。病原菌所以产生抗药性，在细菌群体中传布就是通过转座子。
真核细胞转座子
真核转座机制涉及一个RNA中间体，类似于逆转录病毒（RNA病毒），所以有时把它称为逆转录转座子。转座时通过RNA中间体，再通过逆转录酶合成一个RNA的DNA拷贝，再向原核一样插入靶DNA。差别主要在于真核转座通过RNA中间体。（可能是真核基因不连续性造成的）
转座的遗传学效应
a、转座引起插入突变，可导致基因表达失活。
b、转座产生新的基因。
c、转座产生的染色体畸变，引起DNA缺  失或倒位。
d、转座引起的生物进化，可产生新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。
四、基因突变和基因的损伤与修复
1、基因突变的分类：
a、点突变：DNA分子中单个碱基的改变，一种碱基被另一种碱基取代。同类碱基之间取代，称转换；否则称颠换。
b、碱基的插入突变：在DNA的某一位点插入一个或一个以上的碱基。
c、碱基丢失突变：在DNA的某一位点缺失一个或一个以上的碱基。
2、突变可能造成的后果：
a、突变可能使生物更有利于适应环境，引起生物进化。
b、导致生物体的死亡，属致死突变。
c、引起结构、形态和功能的异常，产生先天性疾病。
d、引起细胞的癌变，癌基因和抑癌基因的突变是许多肿瘤发生的原因。
e、不发生任何变化和影响。
3、  基因突变的特征：
a、突变以一定的概率随机发生。
b、突变有可逆性。
c、突变的发生频率可被外界因素（化学、物理、生物等）所加强。
d、突变是可以遗传的。
4、基因的损伤:基因损伤具有比基因突变范围更广的概念，一切使DNA结构和功能发生改变的DNA变化，都可称为基因的损伤。突变也是DNA损伤的一种，除以上的突变类型外，还包括：
a、碱基损伤。
b、DNA链断裂，有单链断裂和双列断裂。
引起基因损伤的因素：
1）物理因素：
a、紫外线：紫外线照射可能引起DNA连上两个相邻的胸腺嘧啶发生聚合反应，形成胸腺嘧啶二聚体，阻止DNA的复制和转录。
b、电离辐射：X、α、β、γ射线引起DNA的损伤。包括DNA的主链断裂，一条或两条的断裂，碱基聚合，糖苷链的断裂等，引起大片段损伤或丢失，造成染色体畸变、基因突变、细胞死亡等。
2）化学因素
a、烷化剂：烷化剂可与DNA碱基（或糖基上的羟基）发生烷基化反应，生成烷基化碱基。可引起配对错误，发生突变。
b、核苷酸类似物：如5-溴尿嘧啶，是胸腺嘧啶的类似物，在DNA复制时取代胸腺嘧啶进入DNA。5-溴尿嘧啶在体内，以烯醇式存在，再次复制时，与G配对，引起碱基置换突变。
c、代谢产生的活性物质：有两类代谢产生的活性物质，以是从外界进入人体的化合物，本身没有活性，经体内的代谢反应后，产生具有很强反应性的代谢产物，例如苯并芘、黄曲霉毒素等。
3）生物因素  
DNA病毒和RNA病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等都可能使DNA发生改变，引起基因突变。
  4）自发损伤或突变
生物体不接触任何致突变剂，也可能自发的发生基因突变。包括：DNA复制时的碱基错误配对；碱基的互变异构；脱氨基。
5、基因修复
1）直接修复：
a、光修复：是一种酶促反应过程，通过光修复酶，可以修复因紫外线照射引起的嘧啶二聚体的DNA损伤。
b、烷基转移修复：通过甲基转移酶，对引起甲基化的DNA损伤进行修复。
2）碱基切除修复：主要修复小段DNA的损伤，是在DNA聚合酶、DNA糖苷酶、内切酶和连接酶的参与下完成的。
3) 核苷酸切除修复：是大段DNA损伤修复系统，由ATP依赖的切除核酸酶进行δε双切除，即在损伤部位的两侧切开磷酸二酯键，除去损伤的寡核苷酸。留下的缺口，由DNA聚合酶I或DNA聚合酶δ或ε进行修补合成，最后由DNA连接酶连接。
第四章：RNA的结构与功能

转运RNA        tRNA                 转运氨基酸
核蛋白体RNA    rRNA                 核蛋白体组成成分
信使RNA        mRNA                蛋白质合成模板
不均一核RNA    hnRNA                成熟mRNA的前体
小核RNA        snRNA                参与hnRNA的剪接
小胞浆RNA     scRNA/7SL-RNA  蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分
反义RNA    anRNA/micRNA          对基因的表达起调节作用
核酶         Ribozyme RNA          有酶活性的RNA
一、tRNA（结构）
tRNA的分子量一般在25-30KD范围，由73-93个核苷酸组成，其中含大量稀有碱基，如假尿嘧啶核苷(ψ)，各种甲基化的嘌呤和嘧啶核苷，二氢尿嘧啶(hU或D)和胸腺嘧啶(T)核苷等。一般有10-15个稀有碱基,功能不十分清楚。tRNA分子是单股RNA，绝大多数胞浆tRNA含(76+1或-1)个核苷酸，其中有15-16个核苷酸为固定核苷酸，这些核苷酸的种类和位置不变，其它的61-62个核苷酸为可变核苷酸。tRNA的二级结构(三叶草结构) 三叶草结构的共同特点：
(1)氨基酸接受臂：3‘端含CCA-OH序列。
(2)TψC环：由7个不配对的碱基组成，可与核糖体表面结合。几乎总是含5'GTψC3'序列
(3)额外环或可变环：碱基种类和数量高度可变，在3-*个不等，富含稀有碱基。
(4)反密码子环：由7个不配对的碱基组成，处于中间位的3个碱基为反密码子。
(5)二氢尿嘧啶环（D环）：由8-12个不配对的碱基组成。
tRNA（功能）：a、起始tRNA和延伸tRNA ：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他统称为延伸tRNA 。b、同工tRNA：由于一种氨基酸可能有多个密码子，（除色氨酸Trp,UGG以外）如：丝氨酸Ser,UGU\UGC\UGA\UGG，为了识别也就有多个tRNA，即多个tRNA代表一种氨基酸，这些tRNA称为同工tRNA。c、校正tRNA：可以在两个方面起作用，即校正无义突变和错义突变。
无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的和无意义的多肽，这种突变称为无意义突变，tRNA可通过改变反密码子区校正无义突变。
例：大肠杆菌色氨酸合成酶基因突变：在色氨酸合成酶中，一个亮氨酸密码子UUG突变成UAG（终止密码），使合成终止。不能合成有功能的色氨酸合成酶。效正tRNALeu(亮氨酸-tRNA)反密码子，可以从AAC变成AUC去识别UAG,把亮氨酸加上去，使这条肽链能正常合成。
错义突变：是由于结构基因中一个核苷酸的变化，使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码，合成无功能的多肽。tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正确的蛋白质。例：大肠杆菌色氨酸合成酶，一个甘氨酸密码子GGA由于错义突变成AGA(精氨酸），合成错误的多肽链。甘氨酸效正tRNA的效正基因突变使其反密码子从CCU变成UCU，它仍然是甘氨酸密码子，但不结合GGA密码，而识别变异了的AGA密码，从而把正确的氨基酸（甘氨酸）放在AGA密码上。
二、rRNA
占细胞内总RNA量的80%，为蛋白质的合成提供场所。原核生物和真核生物核蛋白体均由易于解聚的大、小亚基组成，原核rRNA主要分为5S、16S、23S三种；真核rRNA主要分为5S、28S、5.8S、*S ，S是大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可反映分子量的大小。
三、mRNA
1、mRNA在细胞内只占总RNA的1%-2%
2、mRNA的代谢很快，细菌mRNA平均半寿期为2分钟，真核mRNA半寿期较长，平均5小时。
3、原核生物mRNA与相应的基因是共线的，并且是多顺反子；真核不是共线，单顺反子，转录产物是hnRNA， hnRNA是mRNA的未成熟前体，也称为不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。
4、hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：一是hnRNA核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子(intron)，而那些保留于mRNA中的片段称为外显子(exon)。也就是说，hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二是mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴。
mRNA5/端的帽子功能：
a、使mRNA免遭核酸酶的破坏，起到保护和稳定性的作用。
b、使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质。
c、被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质合成。
mRNA3/端polyA尾巴的功能：多聚腺苷酸尾一般由数十个至几百个腺苷酸连接而成。随着mRNA存在时间的延续，这段聚A尾巴慢慢变短。因此，目前认为：这种3′末端结构可能与增加转录活性以及使mRNA趋于相对稳定有关。也是分离mRNA和分子克隆的基础。原核生物的mRNA没有这种首、尾结构。
四、snRNA
小核RNA(snRNA,small nuclear RNA)存在于真核细胞的细胞核内，是一类称为小核核蛋白体复合体(snRNP)的组成成分，有U1，U2，U4，U5，U6 等，均为小分子核糖核酸，其功能是在hnRNA成熟转变为mRNA的过程中，参与RNA的剪接，并且在将mRNA从细胞核运到细胞浆的过程中起着十分重要的作用。
五、小胞浆RNA(scRNA)
长约300个核苷酸，主要存在于细胞浆中，是蛋白质定位合成于粗面内质网上所需的信号识别体(signal recognization particle)组成成分。
六、反义RNA（antisense，anRNA）
是近几年发现的，能够对结构基因的表达起调节作用的RNA，由于它能够和有功能的mRNA互补结合，干扰mRNA的转录和翻译，所以也叫mRNA干扰互补RNA，（mRNA interfering complementary RNA，micRNA）。对基因的治疗和表达调控具有重要意义。micRNA的功能：
1）抑制DNA复制：作为DNA复制的抑制因子，它可与引物RNA互补结合。
2）抑制转录：在转录水平上，反义RNA可与mRNA 5’末端互补，阻止RNA的转录。
3）抑制翻译：三种作用，一是与mRNA5’ 端不译区结合，直接抑制翻译；二是与起始密码子结合抑制翻译起始；三是与mRNA非编码区结合引起mRNA构象改变，从而影响翻译。
七、核酶（ribozyme）
具有酶的催化活性可在预选位点剪切RNA的反义RNA又称酶RNA 。RNA具有催化能力的发现，改变了酶都是蛋白质的传统概念。T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA具有催化作用。从而改变了生物催化剂的传统概念。为此他们共同获得了1989年Nobel化学奖。不论是rRNA、mRNA、tRNA都存在有自身催化剪接的功能。核酶目前可分为以下几种：剪切型：对前体RNA（hnRNA）进行剪切。剪接型：包括剪切和剪接，具有连接酶的活性。按底物可分为：自体催化：多数核酶是以自身RNA为底物，进行自我剪切和剪接，许多RNA前体的加工成熟大多是属于自体催化。异体催化：以其他化合物为作用底物，可以是RNA，也可以是多糖。剪接连接点，剪接连接点(splicing junctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。在内含子左侧的连接点称为供体(donor)，在内含子右侧的称为受体(acceptor)。在细胞核的结构基因(即编码多肽的基因)中的所有内含子在外显子-内含子连接处均有GT．..AG的共同顺序。
外显子--↓GTAAGT...内含子...Py10CAG↓...外显子，箭头表示切断的键。
第五章 RNA的生物合成

一、依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP)
①  以DNA为模板，以四种三磷酸核苷为底  物，转录的方式是不对称的。
②  RNA链的延长方向是5’→3’的连续合成。需要Mg2+或Mn2+离子。RNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，所以没有校正功能，不需要引物。  
1、原核生物RNA聚合酶
全酶由六个亚基组成，去掉δ亚基的部分称为核心酶（α2ββ/ ω ）
亚单位    分子量         亚单位数       功      能
   α        36512           2      决定哪种基因被转录
   β        1506*          1      与转录全过程有关
   β/       155613          1      结合DNA模板
   ω        11000
   δ        70263          1      辨认起始点
2、真核生物RNA聚合酶
真核生物有四种RNA聚合酶，分别称RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体RNA聚合酶。
RNA聚合酶Ⅰ：位于核仁中，转录编码rRNA。
RNA聚合酶Ⅱ：位于核质中，转录核内hnRNA
RNA聚合酶Ⅲ：位于核质中，转录合成tRNA和许多小的核RNAs。
二、RNA转录过程可分为识别、起始延长和终止三个阶段。
（一）识别：即RNA聚合酶全酶识别启动子
1、原核生物启动子核苷酸序列的特点：
5’-----  TTGACG  ------  TATAA  -----起始位点-------3’
      -35区            -10区        +1（A、G）
2、真核生物的启动子
-25区有TATA框，又称为Hogness框或Goldberg-Hogness框，-70区有CAAT框，-80~-110区GC。

    5’--GC----------CAAT- --------TATA --------起始位点-------3’
   -80~-110区   -70区        -25区       +1（A、G）
（二）转录起始和延伸
1、原核生物转录起始：当δ亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的-35区-10区序列结合形成启动子复合物。由β亚基催化形成RNA的第一个磷酸二酸键，合成6~9bp时δ因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的δ因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。
2、真核生物转录起始
需要多种蛋白因子的协助，它们与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。
转录因子（Transcription Factor)结合顺序：D-A-B-F-E-H
TFII-D：首先与TATA区结合
TFII-A：稳定TFII-D与TATA区结合
TFII-B：帮助RNA酶与启动子区结合
TFII-F：与RNA酶结合
TFII-E与TFII-H：促进转录起始
（三）转录的终止
DNA模板上的转录终止信号有两种情况，一类是不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用，另一类是依赖蛋白质辅因子才能实现终止作用，这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称ρ因子。两类终止信号有共同的序列特征，在转录终止之前有一段回文结构，使其转录生成的RNA可形成发夹结构  。
第六章蛋白质的结构功能及生物合成
一、蛋白质的一级结构
1、蛋白质一级结构的测定
   1）分离出某蛋白质的mRNA，逆转录生成cDNA,测定此cDNA的碱基序列。
   2）先测定出该蛋白质氨基末端约25个氨基酸残基的序列，制成DNA探针，探测出互补DNA，经PCR扩增再测定其碱基序列。
2、蛋白质家族
在蛋白质进化过程中来自同一祖先蛋白质，随着进化而分化为具有不同功能特征的同源蛋白质。一般认为序列中氨基酸残基组成相同大于50%的属于同一家族蛋白质（protein family）；小于50%称之为超家族蛋白质（superfamily）
二、蛋白质的空间结构
蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构（构象）是指蛋白质的二级、三级和四级结构。
1、蛋白质的二级结构
（1）α－螺旋：含α－螺旋丰富的蛋白质结构紧密而稳定少变，故蛋白质的功能区常不在α－螺旋区而在其邻近。
（2）β－折叠：球状蛋白质中常含有短肽链的β－折叠，富含β－折叠的蛋白质的稳定性较差而易变，常与蛋白质的生物功能有关。
（3）β－转角：肽链走向的多次逆转，主要是通过β-转角来实现的，可使肽链出现*0回折。
（4）无规卷曲：
a、紧密环（compact  loop）：肽链片段的主体结构形成一段开放的环状，其主链卷曲成希腊字母Ω故又称Ω环。Ω环可能与蛋白质的识别功能有关，并参与催化作用。
b、连接条带：α－α连接；α－β和β－α连接；β弓连接了不相邻的β链，形成希腊花边结构。
2、蛋白质的三级结构
是多肽链折叠、卷取的最终状态。由各种二级结构单元以各种连接方式结合成较大的折叠单位，乃至更大的结构域而组成。
（1）超二级结构：α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。
常见的标准折叠单位有αα、ββ、βαβ三种：αα是相邻的两条α－螺旋通过肽链连接而成；ββ是两条平行的链，逆转成发夹结构；βαβ是由α将两条平行的β－折叠末端以右手或左手交叉方式连接起来。
（2）模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域，称之为模体（motif）。
（3）蛋白质的结合位点：蛋白质的表面常带有电荷和疏水基团的独特构型，大小为5~10埃的小区域，称为蛋白质结合位点，当分子与其结合时，可引起蛋白质构象的改变，调节蛋白质的活性。
（4）多结构域蛋白质：大分子蛋白质往往具有多个结构域，三级结构是在其结构域构象的基础上通过肽链连接而完成的。
3、蛋白质的四级结构
是指蛋白质中各亚基间的空间排布及各亚基间的相互作用，不包括亚基内部的空间结构。多数的蛋白质是由多个亚基结合而完成其功能的，既可以是结构相同的亚基结合成，也可以是不同结构的亚基聚合。蛋白质为什麽要采取多亚基形式呢？有以下优点：
a、亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法，如：合成一个6000氨基酸的蛋白质需要*000个bp,如果这个蛋白质是由六个相同的亚基装配而成的，那么仅3000个bp就够了。
b、多亚基形式可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响，如：6000个氨基酸的蛋白质中插入了一个错误的氨基酸，这个蛋白质可能尚失功能，如果此蛋白质是由六个亚基组成，每个亚基含1000个氨基酸，六个亚基之一有毛病，那对他功能影响就要小得多。
c、多亚基蛋白质的活性能够非常有效地和非常迅速地被打开和被关闭。蛋白质通过亚基的解离阻止活性，通过聚合而恢复活性。这对蛋白质活性的调节上是十分方便和必要的。
三、蛋白质的变性与复性（蛋白质的折叠机制）
蛋白质的变性：是指不涉及肽链一级结构断裂而各种次级键乃至二硫键被破坏，导致蛋白质构象（包括二、三、四级结构）变化的过程。
蛋白质的复性：改变环境条件而重新恢复其天然构象的过程。
蛋白质折叠机制：根据蛋白质的复性过程，可以对其折叠机制有所了解。首先成核理论的复性过如下：
a、成核：最先形成α－螺旋及β－折叠片段,  使变性蛋白质从伸展、无活性状态（Us）转变成部分折叠，产生一些二级结构但仍无活性的状态（Ii）。
b、结构充实：从Ii进一步折叠，近于完全，并具有活性，但仍存在着不正确异构体等的状态（In）。
c、最后重排：产生天然蛋白质构象（N）。
全过程是：Us              Ii           In                 N
成核充实重排
四、蛋白质的生物合成
包括氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止及新合成多肽链的折叠和加工。
1．氨基酸的活化：氨基酸必需在氨基酰-tRNA合成酶（AA—tRNA）的作用下先生成活化的氨基酸。原核生物起始tRNA甲酰甲硫氨酸fmet-tRNAfMet。真核生物起始tRNA甲硫氨酸Met-tRNAmet。
2．肽链的起始：原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合；真核生物中40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S.mRNA.Met-tRNAMet起始复合物。均需要GTP提供能量，和Mg2+；起始位点是AUG。
起始因子：原核生物中有三种起始因子
IF-1：能促进IF-2及IF-3的活性。
IF-2：能使fMet-tRNAfMet有选择地与30S亚基结合。
IF-3: 起促进mRNA与30S亚基结合及保持30S亚基稳定性的作用。
真核生物的起始因子大概有10种，其中eIF-2(e表示真核生物)是最重要的一种，它与GTP和Met-tRNA生成三元复合物eIF-2.GTP.Met-tRNA。
3．肽链的延伸和终止：合成的方向是N端到C端。
原核\真核生物*三种终止密码子UAG\UAA\UGA。靠特殊的释放因子（RF）促成终止。有GTPase的活性能水解GTP，使肽链与核糖体解离。原核生物有三种释放因子：RF1，RF2， RF3。真核生物中只有一种释放因子eRF，它可以识别三种终止密码子。
五、蛋白质前体的加工
N端fMet或Met的切除，二硫键的形成，特定氨基酸的修饰，切除新生肽链中非功能片段，多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程。
六、蛋白质合成的抑制剂
许多抗生素都能够抑制细菌细胞内蛋白质合成，5-甲基色氨酸、环己亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白、等也都能抑制蛋白质的合成。
七、蛋白质跨膜转运机制
翻译转运同步机制；翻译后转运机制。
1、信号假设：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段---信号肽，他能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网。然后被内质网中的信号肽酶切除，因此成熟的蛋白质N端并无信号肽。
2、信号识别颗粒：在胞液中有一种信号识别颗粒（SRP），含有300个核苷酸的7S小分子RNA（小胞浆RNA）及6种蛋白质的核糖核蛋白，在信号肽出现后，能识别并结合信号肽及核糖体，使翻译暂停，并与膜上的SRP受体蛋白（停靠蛋白）结合，引导肽链跨膜转运。
3、信号识别颗粒介导新生肽链跨膜机制：伴侣蛋白，多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣（chaperones)或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠。辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质。
第七章：DNA体外重组
一、DNA体外重组的基本含义
1、DNA体外重组的基本概念： DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。
2、DNA体外重组的基本过程：典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：
a、目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的提取
b、限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段
c、酶接：连接到另一DNA分子上（克隆载体）
d、转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞
e、筛选和鉴定:对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定
f、基因表达：对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。
二、限制性内切酶
进行DNA分子的重组，目的DNA和克隆载体都要经切割成连续的、可再生片段，它是由限制性内切核酸酶（Restriction Endonucleosase）来完成的。
1、限制性内切酶的定义：是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。
2、限制性内切酶的发现：1952年Luria和Human发现了细菌能将外来的DN**段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制－修饰。1970年Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为HindII,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。
3、限制性核酸内切酶的命名：按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
4、限制性内切酶的类型：限制性内切酶可分为三大类型：类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，所以在生物工程中很少被应用。类型II ：是生物工程最为常用的工具酶。类型II 限制性内切酶的特点：
a、识别位点严格专一
b、识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp
c、识别位点经常是一种回文序列的DNA
5、常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称                  识别序列和切割点  
EcoRⅠ                                  G↓AATTC
HindII                                   GTPy↓PuAC
HindIII                                  A↓AGCTT
BsuRI                                   GG↓CC
PstI                                     CTGCA↓G n
SmaI                                   CCC↓GGG
XbaI                                    T↓CTAGA
XhoI                                    C↓TCGAG
BamHI                                  G↓GATCC
NotI                                   GC↓GGCCGC
6、限制性内切酶的切割方式
就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种:
a、在对称轴5' 侧切割产生5' 粘端
b、在对称轴3' 侧切割产生3' 粘端
c、在对称轴处切割产生平段
7、限制酶产生末端的连接
a、粘性末端互补
b、不匹配末端连接
c、平末端连接
三、其他常用的工具酶
（一）DNA聚合酶   
1、大肠杆菌DNA聚合酶 I  （E.coli DNA pol I)：具有三种酶活性
a、5’     3’DNA聚合酶活性
b、 3’    5’ 外切酶活性
c、 5’    3’外切酶活性
2、Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’    3’外切酶活性
a、用于同位素标记DN**段末端
b、合成cDNA的第二条链
c、Sanger双脱氧法进行序列分析
d、定位突变
3、噬菌体DNA聚合酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，用途基本与Klenow酶相同，不同之处在于可对3’突出端的DNA分子进行末端标记。这是利用其强劲的3’    5’外切酶活性，切除3’突出端，产生3’凹端。
CTGCCTGCA       T4DNA        CTG             CTACC
GACGG                 32P                GACGG       GACGG
4、Tag DNA聚合酶：是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5’    3’聚合酶活性及依赖于5’    3’聚合作用的外切酶活性，该酶的最适反应温度为75~80 0C，该酶的主要用途是进行PCR反应。
5、逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）：主要作用是将mRNA反转录成cDNA 。
（二）T4噬菌体DNA连接酶
该酶的作用是一个DN**段的5’- P与另一DN**段的3’- OH连接成磷酸二酯键。
（三）碱性磷酸酶
其作用是去除DNA、RNA的5’磷酸根（ 5’-P），以防自身环化；另外在用32P标记5’末端前，可先用其去除DNA或RNA上的5’- P
（四）核酸酶
1、S1核酸酶：主要用于去除DN**段粘末端而产生平端；打开cDNA中发夹结构，使其成平端。
2、核糖核酸酶（RNaseA)：在质粒提取时降解RNA；从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。
四、常用的载体
1、质粒载体
2、噬菌体载体
3、考斯质粒（粘性质粒，cosmid）
理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：
①能在宿主细胞中自主复制。
②容易进入宿主细胞。
③容易插入外来核酸片段。
④容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作。
⑤容易被识别筛选。
1、质粒载体：质粒（plasmid）是存在于细菌中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Co*alently closed Circular DNA, ccc DNA）
(1) 质粒的生物学基本特性
a 、自主复制性：质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
b 、不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。  
c、稳定性d、寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制
e、复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。
f、表现型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等。
（2）质粒DNA的构型
质粒DNA具有三种不同的构型：
a、 SC构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋。
b、 oc构型:两条链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现缺口，称之为开环DNA。
c、 L构型:质粒DNA的双链均发生断裂而形成线性分子。
(3)质粒的命名原则
用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。后面的数字是构建质粒的编号。如：pUC*和pBR322。
（4）质粒的构建
天然质粒存在着缺陷，必须对之进行改造构建：
a、加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。
b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。
c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。
d、改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。
e、加装特殊的基因元件。
（5）质粒的分类
人工构建的质粒根据其功能及用途分为:
a. 多拷贝质粒：用于扩增外源基因。
b. 测序质粒：加装测定顺序所必需的序列。
c. 整合质粒：装有整合促进基因及整合特异序列。
d. 穿梭质粒：能在两种不同的受体细胞中复制。
e. 表达质粒：装有强的启动基因。
f. 探针质粒：筛选克隆或寻找基因元件。
(6) 实验室常用质粒
a、 pBR322
    4.3kb多拷贝松弛型，内含一个复制起点（Ori)、一个抗氨苄青霉素（Ampr ）和一个抗四环素（Tetr ）标记基因，在 Ampr 中有两个内切酶位点（PstI、P*uI)，在 Tetr 中有三个内切酶位点（EcoRV、BamHI、SalI)，此外还有五个内切酶位点（HindIII、EcoRI、A*aI、BalI、P*uII)。
b、pUC*/19
2.8kb，含一个复制起点（Ori)、一个抗性基因Ampr ，一个改造的大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ/,在 lacZ/ 基因中有一段人工合成的含多种内切酶的单一切点，在此位点上插入外源DNA都能灭活下游lacZ/基因。
（7）质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒
I. 碱裂解法
a、将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液
b、加溶菌酶裂解细菌细胞壁
c、加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物
d、加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体  DNA及大部分蛋白质
e、离心取上清液，用苯酚－氯仿溶液处理，灭活去除蛋白质及核酸酶
f、乙醇或异丙醇沉淀水相质粒
g、无DNase的RNase处理残余RNA
II、沸水浴法
a、将菌体悬浮浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中
b、加溶菌酶破细胞壁
c、放入沸水浴中煮40秒
d、离心，用无菌牙签挑去沉淀物
e、乙醇异丙醇沉淀
2、噬菌体载体
噬菌体的繁殖方式有两种：①溶菌性方式（lytic pathway）：利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA先经多次复制合成许多子代λDNA，再装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的λDNA可整合(integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代。
(1)噬菌体的分子生物学：噬菌体是由外壳蛋白和λDNA组成。DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区。左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因。
（2）l－DNA载体的构建
a、缩短长度： 野生型lDNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，那么外源DN**段允许插入的大小至多为2.0kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将其缩短便能够提高装载量。lDNA上约有40-50%的DN**段是复制，裂解所不必需的（中间片段），将之切除便可提高载量，有以下两种类型。
I、插入型载体：该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.5kb（50.5-37kb）由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。
II、取代型载体：该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DN**段，然后用外源DN**段取代之。包装下限为37kb，这类载体不需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去。
b、删除重复的酶切口：插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行，而天然的λDNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除。
(3) l-DNA的体外包装：重组完成的与外源基因杂合分子在体外需人工包装成有感染活性的噬菌体颗粒，方可高效地导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质是噬菌体头部的主要成分，其中以E、A、D为主。可以直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。
（4）l-DNA的抽提
a. 大肠杆菌培养至对数生长期
b. 加入λ-噬菌体或重组l－噬菌体悬浮液，37℃培养1小时
c. 用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时
d. 高速离心，沉淀噬菌体
e. 苯酚抽提，释放l-DNA
f. 乙醇或异丙醇沉淀DNA。
(5) l-DNA作为载体的优点
a 、可在体外包装成噬菌体，能高效感染大肠杆菌
b、装载外源DNA为25kb，远远大于质粒的装载量
c、重组l-DNA的筛选较为方便
d、重组l-DNA分子的提取比质粒容易
      λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
3、考斯质粒（粘性质粒，cosmid）：考斯质粒是含有l-DNA两端cos区的质粒
（1）考斯质粒的构建：由于l-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构建的重组质粒，可装载外源DNA（45.5kb)，它仍可象l-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。
（2）考斯质粒的优越性：能象l-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞；可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DN**段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载45.5kb的外源DNA ；3. 携带质粒的选择标记，便于筛选；有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。
五、目的基因的获得
（一）原核生物基因文库的构建
1、限制性酶切：对提取的总DNA酶解，产生出所有可能大小的片段。
2、载体连接：电泳分离后的DN**段与载体连接。
3、转化：将带有外源DNA的载体导入宿主细胞。首先要使宿主细胞变成感受态细胞，有以下两种方法：
化学方法：细菌用CaCl2在0 oC条件下低渗溶液处理，使细胞肿胀，加入的DNA可以吸附在细胞的表面，在42 oC短处加热时，DNA便被吸入细胞。
电穿孔法：利用高压脉冲，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA便可进入。
4、重组子的筛选与鉴定：常用于筛选鉴定的方法有以下几种：
a、抗生素抗性筛选：
b、抗性的插入失活：在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DN**段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。
c、蓝-白斑筛选：如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。
d、PCR筛选：利用能与插入片段两端互补的特异性引物,以小量抽提的DNA进行PCR分析,能扩增出特异片段的为转化目的重组子。
e、DNA杂交筛选：杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的被标记的已知核酸片段（称为DNA探针）。探针的标记可以用32P或生物素。
（二）真核生物目的基因的获得
1、cDNA文库的构建：
（1）分离提取细胞总RNA
（2）mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的1~2%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。
(3) 以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链：mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3/ -OH引导DNA链的合成，同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。用Rease或碱解去掉RNA链，以DNA链为模板，反向合成DNA第二条链。用S1核酸酶打开发夹结构，并把双链DNA分子的两端切平。所得到的DNA称为cDNA。克隆进载体即构成cDNA文库。
2、cDNA文库目的基因的筛选
（1）对已知序列目的基因的筛选：对于λ噬菌体构件的cDNA文库，筛选的第一步，是把体外包装的噬菌体感染琼脂平板上的菌苔。利用质粒构建的cDNA文库，则把转化的细菌涂布在琼脂平板上。以噬菌斑或菌落的形式显示出文库中的所有信息，每个噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的cDN**段。然后，利用原位DNA探针进行筛选目的基因，核酸探针筛选cDNA文库目的基因。
（2）未知序列目的基因的筛选：a、差示筛选组织特异的cDNA，是利用一对组织基因表达的差异，筛选出其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组基因。差示筛选组织特异cDNA的方法：制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。如：在肿瘤发生和发展过程中，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的基因。也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的基因。
b、用抗体筛选目的cDNA：抗体筛选与核酸探针筛选在构建cDNA文库方面有以下不同：I、cDNA应克隆在表达载体中：表达载体有使外源基因表达的必要调控部分。如启动子、SD序列（核糖体与mRNA起始结合序列）等。cDN**断插入载体，在这些调控元件作用下得到表达。通过表达产物与抗体特定的结合来识别和分离目的cDNA克隆。II、一般以融合的形式表达目的基因：即把cDNA插在细菌基因的下游，使细菌基因的3/ 端与cDNA的5/ 端相连，两个基因融为一体进行转录和翻译，产生一个融合蛋白。在大肠杆菌中，真核基因以融合的形式表达比天然形式要稳定得多，一般也能得到较高水平的表达。III、cDN**段在表达载体中方向的确定：在构建cDNA表达文库时，在cDN**段的两端连上接头，以cDNA5/ 端靠近启动子的方向插入载体。
3、化学合成法获得目的基因：当试验需要克隆一些已知序列的基因时，可以用化学的方法合成该基因片段。先将要合成的DN**段3/端的第一个核苷酸固定于不溶性载体上，然后从此核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应，洗去多余的反应物和副产品，同样步骤与下一个核苷酸进行循环反应。
4、PCR法获得目的基因，PCR的反应体系要具有以下条件：
a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA引物（约20个碱基左右）。
b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。
c、dNTP
d、作为模板的目的DNA序列
PCR反应过程：变性：是PCR反应的第一步，即将模板DNA置于95oC的高温下，使双链DNA解开变成单链DNA。退火：将反应温度降低至55oC使一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对。延伸：将反应体系温度调整到TagDNA聚合酶的最适温度72oC，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链，如此反复30个循环即可扩增得到目的DNA序列。逆转录PCR：这种方法指的是以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA连即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR。锚定PCR：特别适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。即一端已知、一端未知的DN**段。可通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。
六、外源基因表达系统
基因表达是指外源基因克隆到某种表达系统的载体中，再引入合适的宿主细胞中进行表达。表达后的蛋白必须具有原来的生物活性。目前常用的有4种表达系统，大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳类细胞表达系统。
（一）大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌表达的特点：大肠杆菌是基因工程最早采用的一种表达系统，因为培养方法简单、生长迅速、成本低，目前仍得到广泛应用。1978年人类胰岛素基因，1979年生长激素基因，1980年人干扰素基因都是在大肠杆菌中得到表达。
2、外源基因在原核细胞中表达的调控元件：外源基因在原核细胞中表达的强弱，关键因素取决于所用的启动子。强启动子起始合成mRNA的效率高，弱启动子则相反。另外，真核基因在原核细胞中若获得高效表达，必须将基因置于原核的强启动子的控制之下，因为原核生物体内的RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。
（1）大肠杆菌表达载体常用的启动子：LacUV5启动子：来源于大肠杆菌乳糖操纵子。不需要活化蛋白CAP和cAMP，只要有乳糖就能够启动转录。如pOP203-13是含该启动子的表达载体。Trp启动子：来源于大肠杆菌色氨酸操纵子，pDR720是含该启动子的表达载体，启动子的下游有3个SalI、BamHI、Smal酶切位点，可插入外源基因。
（2）核糖体结合位点：核糖体结合位点（SD序列）对真核基因在细菌中高效表达是十分重要的。因为原核基因*它特异性SD序列，因此真核基因在原核生物中表达，在载体上必须有SD序列。SD序列：是由Shine-Dalgarno 1974年首先发现，它是由起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10bp处的3~9bp的序列组成。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA3末端的富含嘧啶的序列互补，mRNA于是可与核糖体很好结合。mRNA5/ -------AGGAGGU-----AUG
rRNA3/  -------UCCUCCA-------
SD序列影响翻译的效果主要取决于下列因素：mRNA的SD序列与16S rRNA3/末端的互补程度，SD序列的核苷酸组成以及与AUG之间的距离3~10bp，AUG两侧位于-20至+13之间的核苷酸组成，mRNA5/ 端形成的二级结构会影响翻译效果。
3、真核基因在大肠杆菌中表达的形式：以大肠杆菌表达外源蛋白，位于胞内、胞外、周质空间三个区域。胞内表达是采用最多的一种方法，外源基因在胞内高效表达，一般占细菌总蛋白10%~70%。
（1）融合蛋白的胞内表达：以融合蛋白形式表达。
（2）非融合蛋白的胞内表达：非融合蛋白的胞内表达时，往往会形成包涵体，是外源蛋白高效表达的一种普遍现象。
（3）重组蛋白的分泌表达：外源基因在大肠杆菌中表达后，胞内蛋白跨过细菌的内膜，定位于周质空间或穿过细菌外膜到达胞外，都称为分泌。
4、大肠杆菌表达系统的缺点：原核细胞内蛋白表达后，缺乏真核细胞特有的加工后处理，如糖基化修饰等。原核细胞内表达的外源蛋白，常以不溶性的包涵体形式存在。利用信号肽虽然可将外源表达蛋白分泌到胞外，但表达的量较低。表达的真核蛋白易被细菌酶水解。表达的真核基因，必须是cDNA，不能表达基因组DNA，因为原核细胞中不能切除内含子。
（二）酵母表达系统
酵母是单细胞生物，具有真核细胞的特点，可以对蛋白进行多种翻译后修饰。
培养比较容易，繁殖迅速增值一代只需几小时。常用的啤酒酵母已被美国确定为安全的生物。具有分泌功能外源蛋白可以分泌到细胞外。遗传背景比较清楚，可以通过改造提高表达水平。但总体上这一表达系统的表达量普遍偏低。
（三）昆虫细胞表达系统
昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白。其优点是：允许插入较大的外源基因。可以胞内表达，也可以进行分泌性表达。
能进行蛋白质翻译后加工、糖基化和磷酸化。杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的。
（四）哺乳类细胞表达系统
哺乳类细胞基因表达系统按其用途可分为两类：一类是用于表达大量外源蛋白另一类用于基础研究，包括基因治疗的研究等。哺乳动物细胞的表达载体通常是来自动物病毒，如SV40病毒，经人工改造，加增强子、启动子等。哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长。
七.转基因动物
转基因动物（transgenic animal)：是指通过基因工程技术，对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，以获得新的遗传性状，可遗传下一代。一般是把外源基因整合到生殖细胞，才能使外源基因传递给下一代；只有部分组织细胞基因组中整合有外源基因的动物称为嵌合体动物，不能遗传。
(一)、转基因动物的发展
1979年Mintz等将SV40病毒DNA导入小鼠，第一次得到载有人工导入外源基因的嵌合体小鼠。1982年Palmiter等将生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，所得转基因小鼠。1985年我国第一例成功的转基因鱼，生长激素基因。此后的发展迅速，相继出现了转基因牛、猪、羊等。
(二)、转基因动物的基本过程
外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中；接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；完成胚胎发育，生长为后代并带有外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜，培育新的纯合系。
(三)、转基因动物的方法
1、逆转录病毒感染法：是利用反转录病毒载体将外源基因转入动物胚胎早期细胞，与受体细胞核基因组整合，然后移植到受体动物中。
2、DNA显微注射法：利用显微注射仪将DNA直接注射入受精卵中，是目前转基因动物的主要方法。以转基因鼠为例具体操作步骤如下：
1) 通过激素使雌鼠超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个。
2) 与雄性小鼠交配，然后杀掉雌鼠，从其输卵管内取出受精卵。
3) 将外源基因注射入受精卵中变大的雄性原核内。
4) 将25-40个受精卵移植入假孕雌鼠子宫内。
5) 约3周受精卵发育成幼鼠，并繁殖成转基因小鼠子代。
6) 从小鼠子代尾巴提取出DNA样品，进行鉴定看是否存在转入基因。
7) 也可通过与另一只鼠进行交配来确定转入基因是否在其生殖系中。
8）通过对子代进行杂交产生纯合的转基因鼠。
显微注射法的不足之处：注射的DNA在宿主基因组中是随机整合的；可能破坏宿主基因的正常表达，影响生理功能；插入的位点可能不适合于外源基因的表达；因此，并不是所有的转基因鼠都能产生预期的性状；DNA显微注射法的总效率较低，只有千分之几；操作技术要求较高。
3、胚胎干细胞法：胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES)：是胚胎发育期的胚细胞，可以人工培养增殖并具有分化成其它类型细胞的功能。ES细胞的培养：分离胚泡的内层细胞团进行培养。ES在无饲养层中培养时会分化为肌细胞、N细胞等多种功能细胞。在含有成纤维细胞中培养时ES将保持分化功能，可以对ES进行基因操作，不影响它的分化功能，可以定点整合，解决了随机整合的问题。
（四）、转基因动物的应用
1、转基因鼠：
（1）建立人类疾病的转基因动物模型，用以模拟人类疾病的起因和发展。
老年性痴呆症：与β淀粉状蛋白体基因有关。自毁容综合征：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的突变失活有关。
（2）利用转基因鼠进行基因敲除试验。基因敲除（gene knock out)：是研究基因的结构和功能最常用的方法，转入基因插入染色体后可能会引起动物的内源基因失活，形成某一基因功能缺失的转基因动物。胚胎干细胞法的定位整合，可获得这样的转基因鼠。
2、转基因牛：乳腺作为生物反应器，改善牛奶的品质，提高酪蛋白含量，转入生长激素基因，提高产奶量。
3、转基因羊：利用乳腺作为生物反应器，转基因羊比转基因牛更易获得，已得到人的凝血酶原激活剂、凝血因子、尿激酶等。改变羊毛的颜色
4、转基因猪：生长激素基因，人的血红蛋白基因。
（五）、转基因动物与克隆动物的区别
转基因动物：是根据人们的需要，经过人为构建的表达载体与基因转入动物体内，以便获得新的遗传性状。
克隆动物：在此克隆的含义有两种认知，一种是不经过受精过程而获得新个体的方法就叫做克隆，所获得的动物即叫做克隆动物；另一种认为只有从一个具有全能性的体细胞直接再生出新个体才叫做克隆。按后一种说法现今的克隆动物都不能叫做真正意义上的克隆动物。
八、单克隆抗体
1、抗体的结构：含有两个轻链L（约210个氨基酸），两个重链H（约450aa),Y字型结构，Y的两个角是抗原的识别位点，约110个aa的排列顺序因抗体的结合特异性的不同而有变化称可变区V，此外是恒定区C和铰链区是酶解敏感位点。
2、单克隆抗体：只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，叫做单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)。一般概念上的抗体通常是指多克隆抗体，由于一个抗原通常*几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。由于多克隆抗体的效价不是专一，很难在临床诊断上应用，因此人们要研制单克隆抗体。
3、单克隆抗体的制备：要制备单克隆抗体，首先要制造出一种可以在培养液中生长繁殖的细胞系，利用这种细胞系来稳定、连续的生产相同的抗体分子。B细胞可以产生抗体，但却不能在培养液中生长繁殖。创造一种杂交细胞，既包含B细胞DNA以产生抗体，也包含另一种相容性细胞类型的细胞分裂功能，使之能在培养液中生长。这种相容性的细胞类型目前已找到的是骨髓瘤细胞，它与B细胞融合，既可以产生抗体又可以在培养液中培养。
4、杂交瘤细胞系的产生：脾B细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合              HAT培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T），生长出来的脾B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。细胞融合物中包含：脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。
骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。骨-脾融合细胞：在HAT中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞分裂功能。
5、杂交瘤细胞抗体产生的鉴定：
6、单克隆抗体的应用：单克隆抗体靶向制剂（生物导弹），癌症化疗药物，溶解血栓药物：纤溶酶原激活剂可激活纤溶酶原生成纤溶酶，降解血纤维蛋白使血凝块溶解。但是纤溶酶同时可以溶解血管壁的组成成分血纤维蛋白原，导致血管壁破裂。纤溶酶原激活剂---单克隆抗体，血纤维蛋白。
第八章：原核生物基因表达调控
一、原核生物基因表达调控总论
原核生物基因调控一般执行如下规律：一个体系需要时被打开，不需要时被关闭。
基因的开与关是相对的。开-关的活性可以通过转录水平上进行调节。基因表达调控主要表现在二个方面：转录水平上的调控（Transcription regulation)，转录后水平上的调控（post-transcription regulation) 包括：mRNA的成熟加工、蛋白质的翻译等。
1、原核生物基因调控机制的类型：a、代谢产物对基因活性的调节；b、弱化子对基因活性的影响；c、降解物对基因活性的调节；d、细菌的应急反应
A、代谢产物对基因活性的调节：诱导调节：是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态（关---开）即在某些物质的诱导下使基因活化。如：乳糖操纵子中的β-半乳糖苷酶基因的表达。阻遏调节：基因平时是开启的，但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭。如：色氨酸操纵子，当培养基中有色氨酸时该操纵子关闭。原核生物基因调控主要发生在转录水平上，负转录调控（negati*e trnscription regulation)，调节基因的产物是阻遏蛋白，阻止基因的转录包括：
负控诱导：阻遏蛋白不与效应物结合时基因不转录。
负控阻遏：阻遏蛋白与效应物结合时，基因不转录。
正转录调控（positi*e transcription regulation)
调节基因的产物是激活蛋白包括：
正控诱导：有效应物时，激活蛋白处于活性状态基因转录。
正控阻遏：有效应物时，激活蛋白处于无活性状态基因不转录。
B、弱化子对基因活性的影响：弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，称为弱化子。
C、降解物对基因活性的调节：有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。因为葡萄糖是最方便的能源，细菌所需能源可从葡萄糖得到满足，无需启动其它基因。
D、细菌的应急反应：当细菌生长过程中，氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生应急反应，停止全部基因的表达。产生应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp），是由空载的tRNA所引起的。空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，ppGpp的出现会关闭许多基因，以应付这种紧急状况。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。
2、启动子与转录起始：转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲合力，从而影响基因的表达水平。-10区与-35区的最佳间距：在原核生物中-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动子-10和-35区之间的间隔为17±1 bp增大或减小能明显影响启动子强度。
3、增强子可以提高转录的水平：除了启动子以外，还有另一序列与转录的起始有关，它是在转录起始点上游约-200bp处的两段72bp长的重复序列，它不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，去除这两段序列会大大降低转录水平。他们的增强效率是不受所在位置的影响的。
4、RNA聚合酶与启动子的相互作用：RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括3各方面：
（1）启动子区的识别：目前认为，RNA聚合酶首先与非特异性结合位点相结合，形成过渡中间体，这种结合促进了酶向启动子移动，最终达到特异性结合。一般认为，酶并不是直接识别碱基对本身，而是通过氢链互补的方式加以识别——氢链互补学说。
（2）酶与启动子的结合：在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物，它是酶与启动子结合的过渡形式；合成开始。二元复合物 = 酶+DNA；三元复合物 = 酶+DNA+RNA
（3）δ因子的结合和解离：δ因子在酶与启动子特异性结合的过程中起重要作用：
①提高酶辨认启动子的能力；②降低酶与DNA的非特异性结合；③促进DNA开链；
④提高RNA链合成起始的速度；⑤阻止酶分子聚合。
5、环腺苷酸受体蛋白对转录的调控：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（ cAMP receptor protein ）， cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（ cAMP acti*ated protein ）。在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。CAP的存在（功能）：能显著提高酶与启动子结合常数。主要表现以下二方面：① CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。② CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。
二、乳糖操纵子
针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jacob和Monod等人于1961年提出乳糖操纵元(lac operon)学说。大肠杆菌能适应外界乳糖供应的变化而改变利用乳糖的状况，是通过乳糖操纵元的调控而实现的，这个模型是人们第一次开始认识基因表达调控的分子机理。乳糖操纵元属于可诱导操纵元(inducible operon)，这类操纵元通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。
（一）、乳糖(lac)操纵元的表达调控
1、阻遏蛋白的负性调控：大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏状态。i基因在自身的启动子Pi控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P1ac的结合，阻止基因的转录起始。当有乳糖存在时，乳糖与R结合，使R四聚体解聚成单体，失去与o的亲和力，与o解离，基因转录开放，β－半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对1ac操纵元的诱导作用。
2、CAP的正性调控：细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。 cAMP与CRP结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。在1ac操纵元的启动子P1ac上游端有一段与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点(CAP binding site)。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，1ac操纵元的结构基因表达下降。由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。
三、半乳糖（gal)操纵子
有葡萄糖存在时gal也能被诱导，不同于lac操纵子，现已分离二类突变株；一类在不含G中高水平合成半乳糖代谢酶；另一类则依赖于G，没有G则不表达半乳糖代谢酶。因此认为gal中可能存在两个启动子。
1、Gal操纵子的结构特征：① gal操纵子有两个启动子，PG1和PG2。两个RNA聚合酶结合位点S1和S2（转录起始点）mRNA可以从两个不同的起始点开始转录。②它有两个O区，一个在P区上游–67~-53，而不是在P区与结构基因之间，另一个O区在结构基因galE内部，现在已知所有操纵子中仅此一例。
2、CAP对gal操纵子的作用：①从S1起始的转录只有当培养基中无葡萄糖（G）时才能进行（与Lac操纵子同）。②从S2起始的转录要依赖于葡萄糖，高水平的cAMP—CRP（无G)能抑制从S2的转录，当有cAMP—CRP时，转录从S1开始，当无cAMP—CRP时，转录从S2开始。
3、双启动子的生理功能：半乳糖对细菌有双重作用；一方面可以作为碳源供细胞生长；另一方面它又是细胞壁的成分。细胞壁合成的前体——尿苷二磷酸半乳糖（UDP—gal），在没有外源半乳糖的情况下，UDP—gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP—G合成的，该酶是galE基因的产物。因此，生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶；另一方面因为合成细胞壁过程中对该酶的需要量很小，本底水平的永久型合成就能够满足生理需要。所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子（S2）进行本底水平的永久型合成；同时以半乳糖作为碳源供细胞生长，需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。有G时转录从S2 开始；无G时转录从S1开始。
四、色氨酸操纵元
色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(trp operon)的调控。
(一)色氨酸操纵元的结构与阻遏蛋白的负调控
合成色氨酸所需酶类的基因E、D、C、B、A，受其上游调控蛋白R基因的调控。R并没有与O结合的活性，只有当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与O结合，阻遏结构基因的转录。即这操纵元通常是开放转录的，当有效应物(色氨酸为阻遏剂)作用时，则阻遏关闭转录。
(二)衰减子（弱化子）及其作用
当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。
１、色氨酸（Trp)操纵元结构特征：a、在色氨酸操纵元P-O与第一个结构基因trpE之间有162bp的一段先导序列含2个相邻的Trp密码子。b、当Trp浓度升高，能够阻止RNA聚合酶的转录。c、含有3对反向重复序列，在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构，使转录终止。
２、衰减子终止转录的作用：a、当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp(色氨酸)量就少，使核糖体沿mRNA翻译移动的速度慢，赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度，这时核糖体占据1位的机会较多，使1、2不能配对，2、3配对，阻止了3、4生成终止信号的结构，RNA聚合酶得以沿DNA前进，继续去转录其后trpE等基因，trp操纵元就处于开放状态。 b、当色氨酸浓度增高时，tRNAtrp色氨酸浓度随之升高，核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快，占据到2段的机会增加，2、3配对的机会减少，3、4形成终止结构的机会增多，RNA聚合酶终止转录的几率增加，于是转录减弱。c、当所有氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据1的序列，结果有利于1、2和3、4发夹结构的形成，于是RNA聚合酶停止转录，等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量”。
第九章：真核生物基因表达调控

一、转录前调控
1、DNA水平的调控—是发育调控的一种形式：包括：基因丢失、扩增、重排和移位等方式。基因丢失：在细胞分化时，消除某个基因活性的方式之一就是从细胞中除去那个基因。目前认为这种调节方式主要是在较低等的真核生物中，如马蛔虫。
2、X染色体失活：雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。
二、转录调控
1、顺式作用元件(cis-acting elements)：主要是起正性调控作用的元件，包括启动子、增强子；近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子。哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件，真核与原核生物启动子的比较
原核生物： TTGACA --- TATAAT------起始位点
            -35         -10
真核生物：增强子---GC ---CAAT----TATAA—5mGpp—起始位点
                  -110   -70      －25                                              启动子中的元件可以分为两种：①核心启动子元件(core promoter element  ,CPE)：指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游－25处的TATA盒。
②上游启动子元件(upstream promoter element  ,UPE)或称上游激活序列（upstream acti*ating sequence,UAS) 包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。
2、反式作用因子(trans- acting factors)：以反式作用影响转录的因子(transcription factors, TF)，RNA聚合酶是一种反式作用因子，及其他协助转录的因子包括：RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子。
3、与DNA结合常见的蛋白质功能域：螺旋-转角-螺旋(helix turn helix,  HTH)；螺旋-环-螺旋(helix loop helix, HLH)；锌指（zinc finger）；碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）；同源域（ Homeodomain）
4、转录活化结构域：带有负电荷的螺旋结构；富含谷氨酰胺的结构；富含脯氨酸的结构。
三、转录后调控
1、RNA加工成熟：无论是rRNA、tRNA、mRNA，转录后都必须经过加工，才能成为有功能的分子。
2、转录后加工的多样性
（1）简单转录单位：编码产生一个多肽，转录后加工有3种形式。基因没有内含子，转录后无需加工，也没poly(A),  如组蛋白基因。没有内含子，无需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干扰素基因。有内含子，需要加工，及加poly(A)尾。
（2）复杂转录单位：转录产物可通过不同的方式加工成两个或两个以上的mRNA。利用多个剪接位点产生不同的蛋白质。有一个起始位点，但有多个加poly(A)位点，不同的剪接方式可得到不同的蛋白质。
四、翻译调控
1、蛋白质合成的起始--扫描模式：40S核糖体首先与mRNA  5 端处结合，向 3 端滑行，遇到AUG起始密码时，与60S结合形成80S起始复合物。即扫描模式。但只有当AUG处于合适的前后序列时才能如此。即A/GNNAUGG，决定了40S是否与60S结合，起始翻译蛋白质。
2、mRNA帽子结构的识别：帽子结合蛋白（cap binding protein,CBP)能专一识别帽子结构的蛋白，具有促进有帽子mRNA的蛋白质合成的活性。mRNA 5 端先导序列，由帽子到起始密码之间的核苷酸序列是不编码蛋白质的，称为先导序列， 742个核苷酸左右，太短影响起始的精确性，但其长度对翻译效率影响不大。
3. mRNA稳定性控制：真核生物能否长时间、及时地利用mRNA翻译出蛋白质以供生长、发育的需要，是和mRNA的稳定性以及屏蔽状态的解除相关的。原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3min。真核生物mRNA的半衰期平均3h，有的长达数天。
4. 蛋白质因子的修饰与翻译起始调控：许多可溶性蛋白因子，即起始因子，对蛋白质合成的起始有重要作用，对这些因子的修饰也会影响翻译起始。
五、翻译后调控
多肽的切割：切去前端的信号肽；多肽的有限水解：酶原水解；多肽的化学修饰：磷酸化、糖基化；多肽的剪接：剪接成数个片段，再以一定的顺序结合起来，形成有活性的蛋白质。
六、真核基因表达调控的特点
1、基因组DNA存在的形式：核小体形成染色质并与蛋白质结合成紧密结构，很难进入转录状态，不具备快速起始的能力。（1）染色质结构影响基因转录；（2）组蛋白的作用；早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。（3）转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加；在核小体区DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNase Ⅰ高敏感点(hypersensiti*e site)。核小体的结构发生变化，有利于调控蛋白结合而促进转录。（4）DNA拓扑结构变化；正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。（6）CG岛；没有被甲基化的CG小片段，称为CG岛。70%的CG岛与持家基因偶联在不同基因中长度大致相同约1~2kb。
2、转录在细胞核、翻译在细胞质中进行：扩大了基因表达调控的范围。
3、基因表达调控在多个水平上进行：顺式作用元件，反式作用因子的相互作用。
4、不同组织和细胞类型合成不同的蛋白质：一个物种的所有细胞含有相同的DNA，在个体发育中开启、关闭基因是受到严格控制的。
5、真核生物基因调控的信号分子：蛋白因子、激素等其它信号分子作为基因的调控物质。
6、持家基因和时态基因：持家基因：不同细胞类型中总有一组经常保持表达状态的基因。时态基因：只有在发育一定时期才能表达的一些特异性基因。
七、真核基因转录调控的主要模式
1、蛋白质磷酸化：ATP或GTP上的磷酸基转移到蛋白质氨基酸残基上的过程，可逆。蛋白质磷酸化与去磷酸化是生物体内普遍存在的信息传导调节方式。
2、蛋白质磷酸化在信号传导中的作用：介导胞外信号专一应答，对外界刺激做出迅速的反应，对外界信号具有级联放大作用，对外界信号的持续反应。
3、跨膜信号转导途径
4、蛋白激酶的种类与功能：根据是否有调节物可分成两大类，信使依赖性蛋白质激酶，非信使依赖型蛋白激酶。根据作用底物可分为三类：丝氨酸/苏氨酸型，酪氨酸型，双重底物特异性蛋白激酶，既可使丝/苏氨酸磷酸化又可使酪氨酸磷酸化。（1）受cAMP调控的A激酶，依赖于cAMP的蛋白酶称为A激酶（PKA），PKA全酶由4个亚基组成(R2C2），C亚基具有催化活性，R亚基具有调节功能，R亚基对C亚基具有抑制作用，全酶（R2C2）无催化活性。R亚基与cAMP结合导致C亚基解离表现出活性。（2）受Ca 2+ 调控的 C激酶，C激酶（PKC）是依赖于Ca2+的蛋白质激酶。IP3（肌醇三磷酸）引起细胞质Ca2+浓度升高，C激酶被DAG（二酰基甘油）和Ca2+的双重影响所激活，使丝/苏氨酸磷酸化导致信号的传递。
5、激素调节：激素调控作用是通过启始基因转录而实现的。cAMP作为第二信使，解除受体蛋白与DNA结合区起始基因表达。
第十章：人类疾病与基因组学
一、常见的人类疾病
人类的疾病从广义上来讲都属于基因病，可将人类疾病分为3大类：单基因病：白化病、血友病、色盲等。多基因病：高血压、糖尿病、神经病等。染色体病：染色体畸变所致的遗传病，如先天愚型、猫叫综合征、性腺发育不全症等。获得性基因病：由病原微生物感染引起。
血友病和红绿色盲、Y染色体限雄遗传、性染色体与性别畸形、先天性睾丸发育不全症等。
二、分子诊断技术
1、酶联免疫吸附诊断：(Enzyme-linked imunosorbant assay,ELISA)待测样品结合在固体支持物上96孔板，加入可以与特异物反应的抗体（一抗），加入酶标记的二抗，加入无色低物。
2、DNA诊断：关键是筛选出特异性的DNA探针，对病原微生物染色体DNA限制性酶切，建立基因文库筛选出特异性DNA探针，通过DNA分子杂交鉴定该种病原微生物，目前已分离出100多种病原菌的特异性探针。
3、PCR诊断：关键是设计合成待鉴定病原菌特异序列的引物，对细菌性疾病的诊断可以防止抗生素的滥用，能检测出病原菌是否带有抗药性基因，利用待测菌不同特异片段设计多对引物即套式PCR能够增大检测的准确性。
4、PCR-酶解鉴定：诊断遗传疾病，如β珠蛋白基因突变造成的镰刀形细胞贫血病，突变恰好是在 C*nI限制性酶切位点，正常CCTGAGG突变成CCTGTGG，在C*nI酶位点两端设计引物PCR扩增后酶切，由于酶切位点突变扩增的产物电泳发生变化。
5、PCR/OLA鉴定：恰好是发生在酶切位点的遗传病是少数，PCR同寡聚核苷酸连接分析结合起来即： PCR   （oligo-nucleotide ligation assay,OLA）用于鉴定其他位点基因突变带来的疾病，原理：假如150位的T突变成G，根据150位两边的序列合成两段探针，检测两段探针是否能够连接，连接的是正常，没有连接的是突变。
6、LCR（ligase chain reaction)连接酶链式反应：设计两对引物1、2和1/、2/引物与模板完全互补，则相邻引物可以在连接酶的作用下连接起来并可通过PCR扩增。模板链发生突变引物无法连接也不能扩增。
三、基因芯片
基因芯片（gene chip)属于生物芯片的一种，将DN**段按预先设计的方式排列在载体上，以此为探针与待检测的基因片段杂交，通过杂交信号进行快速检测。
1、基因芯片的基本原理：依据芯片上的探针与靶基因特异性的杂交，靶核酸提取--扩增--标记―― 芯片制作------基因芯片---核酸杂交---信号检测----数据处理---信息分析。
2、基因芯片检测的特点：在1cm2载体上有数10万个探针进行同步检测，快速全自动分析，高精确度和高灵敏度分析。
3、基因芯片制作的方法：载体材料，主要有玻璃片、金属片和各种有机高分子制作的薄膜等，玻片最为普遍。载体活化：对载体表面进行修饰以便与探针结合，常用的修饰方法为多聚赖氨酸和醛基-氨基法。
1）原位合成法：利用光导合成反应原理，经过修饰带有光敏保护基团的亚磷酰胺（A、G、C、T）为原料，根据需要合成核苷酸序列，用特制的光刻掩模控制载体上光照的位点，指导核酸探针的合成。合成过程：玻片表面铺上一层连接分子，羟基上加有光敏保护基团，光照可以除去。分别用不同的光刻掩模保护不需合成的部位，暴露合成部位。光照下去除羟基上的保护基团，游离羟基。按设计的顺序将带有保护的A、G、C、T中的任意一种与片基上的游离羟基结合。第一个核苷酸与片基连接，更换光敏膜在不同位点连上其他3种核苷酸，经4次将4种核苷酸分别固定在不同的位点上。完成探针的一位单核苷酸的合成。在单核苷酸羟基上加上保护完成第一循环。按同样步骤循环操作可以合成核苷酸长度等于循环次数的核酸探针。如某一含N个核苷酸的探针，通过4×N个化学步骤，合成出4N个可能结构的探针。合成8核苷酸探针，通过4×8=32个化学步骤，合成出48=65，536个可能结构的探针。
2)点样法：利用电脑控制的机械手，按照设定的方案将预先制备好的各种探针点加在片基上不同的位置。点样的密度每块芯片数千到上万条，探针的长度不受限制，比起合成法制作的成本低。
4、基因芯片的检测：待检测样品核酸的分离和纯化，靶基因的扩增和标记，在PCR扩增中加入带有荧光染料标记的单核苷酸，靶基因于芯片上探针结合后便于检出。分子杂交，将靶基因滴在芯片上控制条件与探针杂交，芯片扫描和检测，通过激光共聚焦芯片扫描仪，检测杂交信号，完全杂交信号强否则弱或没信号。根据芯片上各点的信息对样品进行定性定量的分析。数据处理，激光共聚焦芯片扫描仪带有数据分析软件可对检测结果进行处理，如斑点面积、荧光强度等进行计算得出结果。
5、基因芯片的应用：DNA序列测定，假如由8核苷酸组成的探针对靶DNA进行测序
G  A  G T  A  T  A  C  A  A  T  C            靶序列
C  T  C  A  T  A  T  G
     T  C  A  T  A  T  G  T
          C  A  T  A  T  G  T  T                     杂交探针组
               A  T  A  T  G  T  T  A
                    T  A  T  G  T  T  A  G
C  T  C  A  T  A  T  G  T  T  A  G           互补探针序列
基因表达检测：检测mRNA的种类及丰富度，不同时期提取的mRNA进行反转录，并在反转录中进行荧光标记，杂交后进行扫描鉴定那种基因表达了及表达的强度。寻找新基因，突变体和多态性的检测，药物筛选，疾病诊断。
四、人类基因组计划（Human Genome Program，HGP）
对人的基因组3×109 个碱基全部序列的测定，阐明人体中全部基因的位置、结构、功能、表达调控方式及致病突变的全部信息。HGP的研究过程：根据染色体数进行基因组分组，每条染色体确定出DNA序列标志，对基因组DNA进行排序，克隆并测定基因组的全部序列，研究每一个基因的结构、功能、表达调控等性质。HGP的意义：加深人类对自身的了解，对基因表达调控深入研究，认识许多遗传疾病以及癌症等的致病机理，了解人的发育过程有利于人类的健康，了解人类的发展、进化历史。人类后基因组计划：基因克隆计划：克隆仅占2.5%序列的5万个基因的位置，基因组多样性计划：对群体基因多样性和个体基因组特异性的研究。cDNA计划：建立不同组织、不同基因在不同时期的表达。蛋白组计划：从单一的蛋白质转向大规模的种类、结构和功能的研究。细胞计划：阐明信号传导途径认识生命奥秘，HGP的挑战，基因专利化，重视克隆自己的基因。基因工程产业，基因诊断、治疗、蛋白质和细胞计划等需要基因。当前要做的事情，挖掘我国宝贵的遗传病资源，克隆我们自己的相关基因；建立基因组分析与基因克隆能力。中国的HGP指导思想，参与分享，重点是以自己的资源，依靠自己的力量，为子孙后代克隆我们自己的基因。

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哪个学校的？

成天乐

我在网上看到的，就传上来给大家看看有没有什么可用的。。。