分子实验，求思路

baierlug

重吾清越 发表于 2014-12-16 19:22
她要赶人，不回去没地方去，不过我看到有男生在ATM机那读书=皿=。我么，回寝室，洗洗读会书，吃点东西再 ...

同，哪儿背书的都有。

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重吾清越

asuka2015 发表于 2014-12-16 09:23
先别谢！今天凌晨的答案有错！我刚改过来。改为4000+字，把原来的附件删了,请重新下载附件。 ...

按你的想法，那我先用Spe1和EcoRI内切酶切质粒，然后用Sac1和EcoRV内切酶切目的基因，然后我怎么在目的基因上连 Spe1和EcoRI酶切位点呢，而且有方向性地连?

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重吾清越

重吾清越 发表于 2014-12-17 17:37
按你的想法，那我先用Spe1和EcoRI内切酶切质粒，然后用Sac1和EcoRV内切酶切目的基因，然后我怎么在目的基 ...

还有一句，ori为复制起始点origin

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asuka2015

可以这样在平头的基因片段的一边的头上的一条DNA的一端用加上单个脱氧核苷酸往上接上几个单个碱基，然后再接上一段不同长度的DNA，5‘和3’的头一个碱基不同，所以会构成不同的新的粘性末端，不一定完全能够配合，然后用人工合成的一小段分别带有Spe1和EcoRI酶切位点的新的两个片段分别粘结到目的基因片段的两端，另个片段不一样长，这样会有多种比较多的链接，其中有正确的 链接方式——一端连有EcoRI酶切位点的外加小片段DNA，另一端连接有含有的Spe1的外加小片段DNA，这样的片段数量最多，还有其他几种 链接方式，但是基本上没有与这样的连接方式正好两端的小片段对调的方式，为什么，因为我们自己构成的新的粘性末端不同，往上加的单个的核苷酸序列不同。
更简单的一个办法，我们获得了目的基因的mRNA直接用酶黏上新的人为构成的带有Spe1和EcoRI酶切位点的新的两个片段（考虑互补序列），RNA是有方向的，这点可以做到是从5’链接，还是从3‘链接。然后在PT PCR获得带有带有Spe1和EcoRI酶切位点的有方向的目的基因位点。

asuka2015

当然，新粘上的接头，无论是RNA的，还是DNA的，都有包括一个酶切位点和冗余序列。然后在构成DNA双链的目的基因片段后，再用两种限制性内切酶切出两个不同的粘性末端，然后有方向性地接到载体上。

asuka2015

如果楼主仍然认为方向性连接目的基因片段进入载体不可能。那么我告诉你最后也是最直接的方法：直接化学合成目的基因片段，在靠近基因启动子的一端带上EcroRI的切割序列的冗余序列，把那个直接再把pMB的一段基因一并切除的那个内切酶的切口的序列片段的内切酶的切割序列的冗余序列。然后用PCR扩增，得到平头DNA，但是两端的冗余序列中各有一个不同的内切酶识别和切割序列。

baierlug

asuka2015 发表于 2014-12-17 22:43
如果楼主仍然认为方向性连接目的基因片段进入载体不可能。那么我告诉你最后也是最直接的方法：直接化学合 ...

学姐求讲解两个实验技术呗，书上信息太少:Gateway基因克隆技术和热不对称交错PCR。课本写的轻松随意。。求讲解啊！你上传的附件里没这俩。

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Wendy张zyw

asuka2015 发表于 2014-12-13 15:26
我看不清楚，如果要让我回答，请扫描清楚。

你好，请问你知道蛋白质磷酸化对基因表达调控的影响么？

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asuka2015

重吾清越 发表于 2014-12-17 20:07
还有一句，ori为复制起始点origin

基因克隆与转化体筛选应用问题的解答.pdf (201.46 KB, 下载次数: 1)

2014-12-18 00:42 上传

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根据你的全部疑问，我对实验设计又做了补充。请见附件。

asuka2015

Wendy张zyw 发表于 2014-12-17 23:51
你好，请问你知道蛋白质磷酸化对基因表达调控的影响么？

在楼主的两个问题上，我花的时间太多了。

本来我总结了150+本版的试题和习题的解答，现在回答了不到一半，而且试题和习题还在迅速增加。我都来不及录入。